中藥通竅明目IV號對實驗性青光眼視覺誘發(fā)電位的影響

孫 河 董霏雪

通竅明目IV號來源于我們治療青光眼視神經(jīng)損害的中藥經(jīng)驗方，多年的臨床觀察表明，該藥對青光眼視神經(jīng)損害具有較好的治療作用〔1〕，但尚缺少相關的基礎研究，限制了其在青光眼視神經(jīng)保護方面的深入開發(fā)和應用。視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）是視網(wǎng)膜感光細胞受到刺激產生的一種電生理活動，其P1波峰值、潛伏期是反映視神經(jīng)功能狀態(tài)最為可靠和敏感的指標。在本研究中，我們以高眼壓后經(jīng)手術眼壓恢復正常的動物模型為研究對象，觀察了通竅明目IV號對兔閃光視覺誘發(fā)電位（flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP）的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組：純種日本大耳白兔55只，體重 2.5～3.5 kg，雌雄兼用，兔齡為 12～16個月，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。選取其中45只造模。其余10只作為空白對照組。將造模成功后經(jīng)手術治療眼壓恢復正常的40只動物模型分層隨機分為模型組、模型治療Ⅰ組（給予低劑量通竅明目Ⅳ號）、模型治療Ⅱ組（給予中劑量通竅明目Ⅳ號）、模型治療Ⅲ組（給予高劑量通竅明目Ⅳ號）。

1.1.2 主要儀器和試劑：TONO-PEN筆式眼壓計（型號 XL，美國 Medtronic solar公司）；GT-2000NV視覺電生理檢測儀 （重慶國特醫(yī)療設備有限公司）；眼科顯微手術器械、眼科手術顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械設備廠）；卡波姆-940（批號：20040813，購自北京國人逸康科技有限公司）；戊巴比妥鈉溶液；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液眼液（倍諾喜）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備：實驗兔雙眼進行實驗，造模前2%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉（20mg/kg），0.4%倍諾喜滴眼液滴眼行表面麻醉，造模眼在抽取房水0.15 ml后，留置針頭，再向前房內注射同等劑量0.3%復方卡波姆。每日用TONO-PEN眼壓計測量眼壓1次。慢性高眼壓模型造模成功的標準為：眼壓＞22 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并維持 20 d。 造模期間如眼壓＜22 mmHg，重復注藥1次。慢性高眼壓維持28 d后行小梁切除術。在鞏膜瓣完成后于瓣下角膜緣切開一小口，緩慢放出房水，眼壓下降后沖洗前房，行小梁切除、周邊虹膜切除術，術后結膜下注射慶大霉素0.5萬單位，將眼壓降至正常（＜21 mmHg）。術后給予抗生素眼藥膏涂眼，預防感染。

1.2.2 實驗藥品制備及給藥：通竅明目Ⅳ號由柴胡、葛根、當歸、郁金等中藥按一定比例配伍而成，藥物由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，黑龍江中醫(yī)藥大學制劑室加工成濃度為每1 ml含生藥1 g的混懸液，密封，4℃保存?zhèn)溆??？瞻讓φ战M、模型組兔用生理鹽水灌胃，劑量為 4 ml·kg-1·d-1。模型治療Ⅰ組、模型治療Ⅱ組、模型治療Ⅲ組予通竅明目Ⅳ號灌胃， 劑量分別為 3 g·kg-1·d-1、6g·kg-1·d-1、12g·kg-1·d-1，即按照體表面積計算法，分別相當于成人等效治療量及2倍、4倍治療量。模型動物于術后眼壓恢復正常后開始給藥，空白對照組同步給藥，每日1次，持續(xù)1個月。

1.2.3 F-VEP的檢查方法：所有兔均在麻醉狀態(tài)下于暗室內進行F-VEP檢查，實驗特定支架固定動物，引導電極由兩耳連線中點插入枕外粗隆上方骨膜下，參考電極插入額部兩眼連線中點下，接地電極置于右耳后皮下，經(jīng)鱷魚夾聯(lián)線將信號輸入測試儀。兔眼距屏幕30 cm，暗適應10 min后開始記錄。采用全視野刺激球白色閃光刺激，背景無色，刺激模式為單刺激，頻率2 Hz，刺激次數(shù)50，每次采樣時間500 ms，波形疊加100次，連續(xù)測量至少2次，每次間隔10 min，記錄穩(wěn)定波形2次。雙眼檢測，當檢查動物一眼時，用不透光眼罩完全遮蓋對側眼。本實驗所用的電極由針灸針改造而成，操作時注意勿使電極損傷動物的腦組織。F-VEP的檢查時間為給藥后1個月，以P1波幅值（μV）和潛伏期（ms）為觀測指標。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 16.0軟件包進行分析，慢性高眼壓造模前后與對照組比較用t檢驗，多組之間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 高眼壓模型兔的眼壓

造模前空白對照兔和擬造模兔的眼壓分別為（14.60±3.17）mmHg，（14.37±2.77）mmHg，差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）；造模兔前房注入卡波姆4周后眼壓升高到（36.36±7.66）mmHg，明顯高于同期的空白對照兔，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1）。 說明前房注入卡波姆的方式可以有效建立高眼壓實驗動物模型。

表1 高眼壓模型兔與空白對照兔的同期眼壓比較（±s，mmHg）

表1 高眼壓模型兔與空白對照兔的同期眼壓比較（±s，mmHg）

注：與空白對照兔比較，①P<0.01（兩獨立樣本t檢驗）；1 mmHg=0.133 kPa

組別 眼數(shù)/只 測量眼壓時間模型兔造模前 模型兔造模后4周高眼壓模型兔 90 14.37±2.77 36.36±7.66①空白對照兔 20 14.60±3.17 14.8±2.67

2.2 模型組與模型治療組小梁切除術后眼壓比較

施行小梁切除術后，模型兔有6只眼眼壓未能控制，2只眼睛出現(xiàn)前房出血，2只眼脈絡膜脫離，予剔除。我們將剩下的40只隨機分模型組、模型治療Ⅰ組、模型治療Ⅱ組、模型治療Ⅲ組。每組10只（20只眼），隨后我們又對各組小梁切除術后的眼壓恢復情況進行統(tǒng)計，結果顯示各組眼壓無明顯差異（P>0.05）（表 2）。

表2 各組小梁切除術后眼壓情況（±s，mmHg）

表2 各組小梁切除術后眼壓情況（±s，mmHg）

注：各組比較，P＞0.05（單因素方差分析）；1 mmHg=0.133 kPa

組別 眼數(shù)/只 小梁切除術后眼壓模型組 20 16.80±2.07模型治療Ⅰ組 20 17.00±2.66模型治療Ⅱ組 20 16.95±2.59模型治療Ⅲ組 20 16.00±2.62

2.3 F-VEP檢查

2.3.1 P1波潛伏期：模型組及各模型治療組的P1波潛伏期較空白對照組延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的P1波潛伏期較模型組縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。各模型治療組間比較，Ⅰ組的潛伏期較Ⅱ、Ⅲ組長（P＜0.05），但Ⅱ、Ⅲ組之間無統(tǒng)計學意義的差異（P＞0.05）（表 3）。

2.3.2 P1波振幅：模型組及各模型治療組的P1波振幅較空白對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型治療Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的P1波振幅均較模型組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。各模型治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表 3）。

表3 各組兔F-VEP P1波振幅及潛伏期比較（±s）

表3 各組兔F-VEP P1波振幅及潛伏期比較（±s）

注：與模型組比較，①P<0.01；與空白對照組比較，②P<0.01；與模型治療I組比較，③P<0.05（單因素方差分析）

組別 眼數(shù)/只 P 1波潛伏期/m s P 1波振幅/μ V空白對照組 2 0 3 4.4 5±3.1 9① 1 7.7 9±3.4 2①模型組 2 0 5 0.5 2±2.8 4② 9.7 7±2.6 4②模型治療Ⅰ組 2 0 4 7.2 4±2.3 7①② 1 3.1 3±3.4 7①②模型治療Ⅱ組 2 0 4 5.3 8±3.3 6①②③ 1 3.5 2±2.5 6①②模型治療Ⅲ組 2 0 4 4.8 4±2.7 1①②③ 1 3.2 0±2.6 7①②

3 討論

青光眼是一種發(fā)病機制復雜，以視野缺損、視神經(jīng)萎縮為主要臨床表現(xiàn)的高致盲眼病。若得不到恰當治療最終會導致失明。傳統(tǒng)觀點認為高眼壓是引起青光眼失明的主要危險因素，而我們在臨床上發(fā)現(xiàn)很多患者的眼壓雖然控制正常，但視野損害仍在繼續(xù)。國外資料顯示約有1/7的青光眼患者，在其眼壓控制良好的7年中，視野缺損仍然在持續(xù)增加。20%的青光眼患者眼壓雖然下降了30%，但在其后的3~5年時間里病情仍然在繼續(xù)發(fā)展〔2〕。這表明即使眼壓得到了有效控制也不能完全阻止青光眼視神經(jīng)損害的發(fā)生，在降低眼壓的基礎上，還應注重和加強對視神經(jīng)的保護。

通竅明目Ⅳ號為臨床經(jīng)驗方，組成藥物有柴胡、葛根、當歸、郁金等，以疏肝解郁，開竅明目，化瘀散結通絡為主要立方原則。課題組從1998年至今，不斷觀察通竅明目Ⅳ號治療青光眼視神經(jīng)損傷的療效。肯定療效后，又對適應癥、禁忌癥進行篩選，并于2002年開始較為系統(tǒng)地與西藥和中西藥結合療法進行對比研究，結果證實了通竅明目Ⅳ號的臨床治療價值〔1〕。大量臨床研究表明，通竅明目Ⅳ號對于青光眼引起的視神經(jīng)損害，具有提高視力、擴大視野的作用，且無不良反應。

人眼青光眼視神經(jīng)損害在VEP上表現(xiàn)為振幅降低，潛伏期延長，青光眼視神經(jīng)損害越嚴重，VEP的相應改變也就越明顯。研究〔3〕認為VEP潛伏期的長短可以反映視神經(jīng)髓鞘功能狀態(tài)，波幅的高低反映軸索功能狀態(tài)。劉婉瑩〔4〕等建立SD大鼠輕、中、重度視神經(jīng)不完全損傷模型，并記錄視神經(jīng)正常及損傷后大鼠F-VEP潛伏期和振幅的變化，發(fā)現(xiàn)大鼠損傷后F-VEP的變化規(guī)律與神經(jīng)損傷程度一致，并認為F-VEP是客觀反映視神經(jīng)功能的一項可靠指標。馬建州等〔5〕在觀察高眼壓模型大鼠F-VEP變化的研究中發(fā)現(xiàn)，模型建立2個月時AP1（N1-P1振幅）降低，至第6個月是仍未恢復；LP1（P1波潛伏期）在造模第2個月時未見明顯變化，到第6個月時則出現(xiàn)明顯延遲，認為F-VEP的改變與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞減少和視神經(jīng)纖維密度減低相吻合，F(xiàn)-VEP可以客觀反映高眼壓模型的視功能狀態(tài)。另外，有人根據(jù)VEP波幅的下降程度，估計視神經(jīng)損傷的預后。國內臨床研究〔6〕顯示，當F-VEP波幅降低超過健眼68%或消失時，治療效果不佳，預后不良；當F-VEP振幅降低幅度小于健眼的55%時，經(jīng)過積極治療，可有較好預后。Akabane等〔7〕的研究結果相比國內更為保守，認為如果重要波形的波幅下降超過50%，即可認為視神經(jīng)的損傷不可逆。

由于P1波的振幅和潛伏期會受實驗條件、刺激和記錄方法、動物個體間差異的影響，F(xiàn)-VEP值沒有一個統(tǒng)一的標準值，所以我們在實驗中以自身作為對照，探尋藥物對VEP的影響。

本實驗中，模型組及各治療組的VEP結果均較空白對照組差（P＜0.01），而治療組的P1波潛伏期、振幅又較模型組有明顯改善（P＜0.01），這一方面說明卡波姆誘導的高眼壓已造成了對視神經(jīng)的損傷，模型制作是成功的，另一方面則提示通竅明目Ⅳ號對青光眼引起的視神經(jīng)損害具有一定的保護作用。從藥物的量效關系上看，各劑量治療組的差異主要表現(xiàn)在P1波潛伏期方面：模型治療Ⅱ組、Ⅲ組的潛伏期均較Ⅰ組縮短（P＜0.01），各治療組間P1波振幅則無明顯差異（P＞0.05）。提示就VEP潛伏期而言，中、高劑量通竅明目Ⅳ號的視神經(jīng)保護作用較低劑量明顯。

總之，本實驗研究表明高眼壓因素確實造成了兔的視神經(jīng)損害，并可能伴隨有視神經(jīng)髓鞘及軸索功能狀態(tài)的改變，從而影響神經(jīng)沖動的傳遞而使P1振幅下降、潛伏期延長。通竅明目Ⅳ號可能是通過改善視神經(jīng)髓鞘、軸索功能狀態(tài)，修復部分已經(jīng)受損的視神經(jīng)，起到保護視神經(jīng)的作用。至于該作用與給藥劑量的大小是否存在確切關聯(lián)，尚有待今后進一步的實驗研究來明確。

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