天麻共生蜜環(huán)菌母種及液體種培養(yǎng)基的優(yōu)化*

劉 冰，牛 蕓，張德著，張漢波，楊明摯**

（云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091）

蜜環(huán)菌以菌索的形式侵入天麻營養(yǎng)繁殖莖并被同化，是天麻無性繁殖階段的唯一營養(yǎng)源[1]。在生產(chǎn)流程上，天麻種植用蜜環(huán)菌菌種分為三級：母種 （一級）、原種 （二級）和栽培種 （三級）。從天然環(huán)境中分離純化得到的母種經(jīng)擴大培養(yǎng)成為生長旺盛的原種，再接種于固體培養(yǎng)料形成用于轉(zhuǎn)染菌材的栽培種。一級、二級菌種的質(zhì)量好壞影響到三級菌料及菌材上菌索健壯程度及多寡，而后者則直接決定了天麻的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。目前常用固體PDA加富培養(yǎng)基培養(yǎng)母種，蜜環(huán)菌雖能在其基質(zhì)中生長但存在菌絲易于老化、菌索細弱長勢差等缺點[3]。原種則多采用木屑培養(yǎng)基或液體PDA加富培養(yǎng)基[1-2]。然而目前液體培養(yǎng)方法主要集中于工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域，研究所得的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不適合在天麻種植戶中推廣。本試驗擬在現(xiàn)有研究成果上針對母種及原種培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期篩選出菌絲體性狀優(yōu)良且高產(chǎn)的固體母種配方和適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實際的液體原種配方。

1 材料與方法

1.1 材料

直徑1cm及以下板栗細小枝條 （Castarea mollissima）和玉米芯采自昆明市郊。馬鈴薯購自市場，其余試劑類均為國產(chǎn)分析純。普通型及加富型PDA培養(yǎng)基 （固體型及液體型）配方參考徐錦堂[1]、蘭進[2]等。自昭通彝良小草壩采集的腐爛木材韌皮部中分離得到的蜜環(huán)菌 (Armillaria mellea)菌株，利用ITS序列進行分子鑒定后，保存于普通PDA培養(yǎng)基上備用。

1.2 方法

1.2.1 母種培養(yǎng)

切取約0.5cm3大小的供試菌株菌塊接種于裝有20 mL加富型固體PDA斜面試管 （18 mm×180 mm）中。25℃恒溫暗箱培養(yǎng)30 d，培養(yǎng)基內(nèi)長滿白色粗壯菌索后待用。

1.2.2 液體菌種制備

截取高度2 cm上述含菌索母種，盡量剔除附著的半固體培養(yǎng)基后充分剪碎。接種于含125 mL加富型PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。置于旋轉(zhuǎn)式搖床28℃恒溫、120轉(zhuǎn)·min－1搖瓶培養(yǎng)3 d至菌液呈淺紅色待用。

1.2.3 母種固體培養(yǎng)基正交優(yōu)化

參考彭述敏等[4]、程顯好等[5]的單因素營養(yǎng)條件篩選結(jié)果，選取葡萄糖、酵母浸粉和無水乙醇作為影響因子。設(shè)計3因素3水平的正交試驗 （表1），并按表1配制9個試驗號的培養(yǎng)基，并設(shè)固體PDA加富培養(yǎng)基為對照組。滅菌后每20 mL培養(yǎng)基倒入直徑9 cm平板，每試驗號5皿重復(fù)。 每皿接種1.2.2中培養(yǎng) 3 d的液體菌液 0.2 mL并涂布均勻。測定25℃恒溫培養(yǎng)13 d后的生物量及菌絲體性狀。

表1 正交試驗的因素及水平

1.2.4 液體原種培養(yǎng)基制備及優(yōu)化

將原材料在65℃下烘干并剪成1 cm～2 cm的小段。稱取100g原材料碎段，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾后滅菌保藏。在100 mL三角瓶中分別添加10 mL、20 mL、30 mL和40 mL板栗枝條煮汁，用普通PDA培養(yǎng)基母液補齊至50 mL。采用玉米芯煮汁和蒸餾水代替上述板栗汁，得到三個系列四個梯度 （20%、40%、60%、80%）的培養(yǎng)基，每組三次重復(fù)。121℃高壓滅菌后，每瓶接種1.2.2中培養(yǎng)的液體菌種4 mL。測定室溫、黑暗條件下?lián)u瓶25天的生物量。比較各組差異，確定原料煮汁的最適添加量。根據(jù)上述實驗所得結(jié)果，在添加劑總量為30 mL下將板栗煮汁和玉米芯煮汁進行組合。100 mL三角瓶中分別加入板栗煮汁0、10 mL、15 mL、20 mL和 30 mL，用玉米芯汁補足30 mL。每組再加20 mL普通PDA母液，得到五組不同濃度比 （0∶3、 1∶2、 1∶1、 2∶1、 3∶0）培養(yǎng)基。另設(shè)50 mL液體加富PDA作為對照，各組均3次重復(fù)。接種菌液4 mL，測定室溫黑暗搖瓶15 d后菌絲體性狀及生物量。

1.2.5 碳源的選擇優(yōu)化

根據(jù)1.2.3中結(jié)果，用蔗糖等量替換PDA母液中葡萄糖制成PSA母液。在100 mL三角瓶加入30 mL組合添加劑 （板栗液：玉米芯液=1∶1），再分別添加20 mLPDA母液和PSA母液。接種菌液4 mL,測定室溫黑暗搖瓶15 d后菌絲體特征及生物量。比較不同碳源對菌體生長的影響。

1.2.6 菌絲體的生物量測定方法

固體培養(yǎng)所得單菌落切下置于80℃水浴中5 min，使菌索附著的培養(yǎng)基充分溶解；液體培養(yǎng)所得菌絲球用4層紗布過濾，并用蒸餾水沖掉附著的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移至已知質(zhì)量的濾紙上，置于65℃烘箱中烘干至恒重，分析天平稱重。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

參考唐啟義等的方法[6]，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) V3.01進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 母種培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果及分析列于表2和表3。其中干重最高為8號。極差RC>RB>RA，影響因素主次為：C（乙醇）＞B（酵母膏）＞A（葡萄糖），且C與B之間差異極小。直觀分析最佳組合應(yīng)為A1B3C3。A1B3C3為3號培養(yǎng)基，但干重不及8號 （A3B2C2）。從生物量角度考慮，最佳組合應(yīng)為A3B2C2 （表2）。

表2 L9（33）正交試驗結(jié)果

方差分析顯示，酵母膏、葡萄糖和乙醇對菌體生長均無顯著影響 （FA＜FB＜FC＜F(6,2)0.05）。 同時誤差平方和SSe過大，占總平方和的32%，推測三因素之間可能存在交互作用。故無法用正交方差分析結(jié)果進一步優(yōu)化組合（表 3）。

表3 正交試驗方差分析表

將培養(yǎng)基組合做單因素分析，各培養(yǎng)基菌絲體性狀及生物量見表4。8號、3號和5號所得菌絲體干重分列前三位，三者所得菌絲體性狀一致。8號和3號的干重與其余各組存在極顯著差異。其余各組間 （含對照組）菌絲體干重均無顯著差異，但所得菌絲體的性狀存在差異 （表4）。

2.2 板栗和玉米芯提取液對蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同比例添加劑的培養(yǎng)基在室溫搖瓶培養(yǎng)25 d后獲得的菌絲生物量及其方差分析結(jié)果列于表5。添加同種成分在不同比例間所得菌絲體干重差異極顯著 （F板栗液=684.757＞ F 水 =239.84＞ F 玉 米 芯 液 =181.451＞F(8,3)=8.85）。板栗液比例在20%、40%和60%都對菌體量增加有極顯著促進。玉米芯提取液只有在添加到40%和60%才顯著促進菌絲體增重。其中在本次單因素實驗中當板栗枝葉提取液添加到60%時以及玉米芯提取液添加到40%時對密環(huán)菌菌絲體生長促進作用分別達到最大值。比較兩者的促進生長效應(yīng)，在任何添加比例下板栗枝葉提取液對密環(huán)菌的促生長作用均顯著優(yōu)于玉米芯提取液 （表5）。

表4 各試驗號菌絲體屬性及方差分析

表5 不同比例的板栗枝葉和玉米芯提取液添加隊菌絲體生物量的影響

2.3 兩種添加成分組合與優(yōu)化

同時添加板栗枝和玉米芯提取液，不同比例的混合組合對密環(huán)菌菌絲體生長的促進作用有差異。其中添加比例為1:1時的生物量最高，3:0組次之，二者與其它各組均達到極顯著差異。使用添加劑組合獲得菌球比加富型PDA的個體更大，在菌球顏色和老化情況方面均有不同程度的差異 （表 6）。

2.4 碳源選擇優(yōu)化結(jié)果

在上述實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別探討了葡萄糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葡萄糖組和蔗糖組在產(chǎn)量上的差異并不明顯。所得的菌球在個體大小和數(shù)目都較一致。除蔗糖組的顏色稍淺外，其它特征均與葡萄糖組相同（表7）。

3 討論

伴栽天麻的蜜環(huán)菌菌株宜選擇菌索粗長、分支多、生物量大、健壯度高的菌株，這樣的菌株侵染機率高并能長期供給予天麻充足的營養(yǎng)[1]。生產(chǎn)用菌株的質(zhì)量不僅取決于母種的遺傳屬性，還有賴于培養(yǎng)基質(zhì)的營養(yǎng)條件。本試驗所得最佳固體母種培養(yǎng)基配方 （每升培養(yǎng)基含葡萄糖25 g、 酵母粉 2 g、 乙醇 5 g、 K2PO43g、 MgSO41.5g、 VB110 mg及瓊脂15g）與目前廣泛使用的固體PDA加富培養(yǎng)基相比，菌絲體長勢更好，產(chǎn)量達2倍以上。同時菌索性狀優(yōu)良，更適合用于天麻栽培；菌絲老化程度低、不易核化，更符合長期保藏的需求。

彭述敏等[4]的單因素營養(yǎng)條件篩選結(jié)果顯示，葡萄糖和酵母膏分別是2株昭通本地天麻共生蜜環(huán)菌生長的最優(yōu)碳源和氮源。程顯好等[5]發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中在適宜的范圍內(nèi)增加乙醇濃度能顯著促進蜜環(huán)菌菌絲體產(chǎn)生。Weinhold研究了乙醇作為有機生長因子，少量 （0.05%）添加至以0.5%葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上，可以顯著促進菌絲的旺盛生長和菌索的大量產(chǎn)生[7]。由于本試驗中各因素間可能存在互作，乙醇對菌絲體生長的促進作用可能是影響了蜜環(huán)菌對葡萄糖或酵母膏的吸收以及菌體內(nèi)的代謝過程。應(yīng)在本試驗因素水平上設(shè)計L18（37）正交試驗 （增加因素A×B和A×C），確定互作發(fā)生的位置，這對揭示乙醇的作用機理有一定意義；并利用正交方差分析確定最高產(chǎn)組合，同時結(jié)合菌絲體性狀考察，進一步優(yōu)化母種配方。

表6 2種添加劑組合對菌體特征及生物量的影響

表7 不同碳源對菌絲體特征及生物量影響

二級菌種的作用是在三級固體菌料或菌枝上繼續(xù)擴大培養(yǎng)。采用液體搖瓶方式培養(yǎng)二級菌種較之傳統(tǒng)以樹葉木屑為基質(zhì)的固體培養(yǎng)方式，產(chǎn)生的菌絲體生長點多、菌齡一致，接種于三級培養(yǎng)料后生長速度快、分布均勻[1－2]。從生產(chǎn)角度看，液體菌種培養(yǎng)成本低、原料利用率高，易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。液體二級菌種以菌球個體大，菌絲結(jié)合緊密，健壯度高為優(yōu)。這樣的菌種抵抗不利環(huán)境能力強，在新營養(yǎng)條件下的適應(yīng)期短，菌絲萌發(fā)快；同時單位體積內(nèi)菌絲量多，培養(yǎng)三級菌料的周期短[8]。

蜜環(huán)菌在自然環(huán)境中往往生長在殼斗科植物莖干或根部，也有報道稱采用玉米芯介質(zhì)能成功培養(yǎng)蜜環(huán)菌。板栗提取液中促進菌絲體增殖有效成分可能是無機鹽類和酚類化合物。蜜環(huán)菌生長需要大量的錳、磷、鉀和硫元素。自然條件下板栗枝條貯存著較高水平氮 （0.6%）、磷（0.2%）、 鉀 （0.3%）元素以供給果實的營養(yǎng)積累[9]，在人工施肥情況下含量則更高。果樹韌皮部含有的某些酚類化合物被證實可以刺激菌索的生成[7]。玉米芯中含58.4%的可溶性碳水化合物和2.0%粗灰分[10]，可作為有效碳源和無機鹽的補充。兩種提取液組合使用的效果比單獨添加好，可能是豐富了營養(yǎng)物種類并輔助或刺激了基礎(chǔ)營養(yǎng)物吸收利用。

實驗獲得蜜環(huán)菌液體原種培養(yǎng)基 （每升培養(yǎng)基含馬鈴薯80 g、蔗糖8 g、板栗枝段 30 g、玉米芯碎塊30 g），培養(yǎng)所得菌絲體產(chǎn)量高，菌球數(shù)目多、個體大、健壯度高。在各指標上均優(yōu)于目前常用的加富型PDA液體配方，同時節(jié)約馬鈴薯和糖各60%。該配方成本低、原料易得、操作簡單，適合用于實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。板栗是云南省廣泛栽培的經(jīng)濟作物，每年因避免果樹徒長會產(chǎn)生大量的修剪枝條。玉米芯也是廣泛而廉價的原料來源。而這部分農(nóng)業(yè)廢棄物由于可利用力面窄，往往用于焚燒供能。蔗糖較之葡萄糖，價格便宜且易獲得，種植戶在實際生產(chǎn)中可以使用食用白糖代替。天麻種植戶利用上述原料培養(yǎng)蜜環(huán)菌液體菌種，可以成本降低并獲得較高質(zhì)量的菌株，同時實現(xiàn)廢物利用，減少對環(huán)境的污染危害。

[1]徐錦堂，冉硯珠.中國天麻栽培學(xué) [M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1993

[2]蘭進，徐錦堂，陳向東.天麻栽培技術(shù)百問百答[M].(第二版).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009

[3]熊鷹，姜鄰，唐利民.蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)基篩選試驗[J].中國食用菌.2004,23(5):25－26

[4]彭述敏，陳玉惠，程立君等.2株優(yōu)良天麻共生蜜環(huán)菌生長條件篩選[J].中國食用菌.2010,29(4):22－25

[5]程顯好，劉林德，董洪新等.蜜環(huán)菌菌絲體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中藥材.2007,30(5):509－512

[6]唐啟義.DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)－－實驗設(shè)計、統(tǒng)計分析及模型優(yōu)化[M].北京：科學(xué)出版社，2006

[7]秦國夫， 趙俊，郭文輝.蜜環(huán)菌的生物學(xué)研究進展[J].東北大學(xué)學(xué)報.2004,32(6):89－94

[8]華秀愛.速培蜜環(huán)菌促進天麻速生高產(chǎn)實驗 [J].中國食用菌.2003,23(1):27－29

[9]高新一.板栗栽培技術(shù)[M].(第三版)北京:金盾出版社，2009

[10]馮景剛.玉米芯生料袋栽香菇的試驗 [J].中國食用菌.2004,23(2):36－44