桑黃多糖抗疲勞及耐缺氧實(shí)驗(yàn)研究

郭俊平，趙述淼，馬姝萍，梁運(yùn)祥*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

桑黃 (Phellinus linzeus)又名桑臣、桑耳、桑黃菇等。分類學(xué)上屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、針層孔菌屬，是大型珍稀藥用真菌[1]。桑黃含有多種化學(xué)成分，其最主要的活性成分是多糖。近年來，許多真菌研究者致力于桑黃抗腫瘤活性的研究，而對桑黃多糖的抗疲勞和耐缺氧活性研究甚少[2－3]。因此，對人工培養(yǎng)桑黃中的多糖進(jìn)行生物活性研究，對開發(fā)利用我國珍稀藥用真菌資源具有重要的學(xué)術(shù)意義，并且對桑黃天然藥物和保健品的開發(fā)也具有一定的應(yīng)用價值。

本研究將從灌胃小鼠抗疲勞和耐缺氧作用兩方面，探討桑黃多糖對改善機(jī)體體質(zhì)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩解體力疲勞功能檢測程序和方法見 《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范 （2003版）》，主要采用負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行血清尿素氮測定、肝糖元測定、和血乳酸測定；其負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原3項(xiàng)生化指標(biāo)中任2項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用[4]。

提高缺氧耐受力功能檢測程序和方法見 《保健食品功能學(xué)評價程序與檢驗(yàn)方法規(guī)范》 (2003版)。通過常壓耐缺氧、亞硝酸鈉中毒、急性腦缺血性缺氧3個動物實(shí)驗(yàn)來認(rèn)定"耐缺氧"的保健功能。如果3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中任意兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示為陽性，就說明該產(chǎn)品有提高缺氧耐受性的保健功能[4－5]。本文選擇常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)和亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)。

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

實(shí)驗(yàn)菌株為桑黃 （P.linzeus），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為雄性KM小鼠，300只，體重約20 g～23 g來自湖北省疾病控制中心，許可證號：SCXK(鄂)2008－0005。

1.1.3 試劑

肝糖原、血乳酸、血清尿素氮測定試劑盒 （購買于南京建成生物工程公司）、鈉石灰 （上海五四化學(xué)試劑有限公司），亞硝酸鈉、苯酚、硫酸、乙醇及其他試劑均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DU800分光光度計 (美國 BECKMAN COULTER公司)；5810R臺式高速冷凍離心機(jī) （德國艾本德公司）；AR1530分析天平 （美國奧豪斯公司）；HQL150C恒溫?fù)u床 （武漢中科科儀有限公司）；GHP－9270恒溫培養(yǎng)箱 （上海索譜儀器有限公司）；SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；計時秒表；鉛皮。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃多糖的提取

桑黃菌種經(jīng)發(fā)酵篩分得到的菌絲體，料水比為1∶70，90℃水浴浸提3 h，抽濾，取濾液，加入適量的α－淀粉酶，60℃酶解1 h后，濃縮至所需體積，再向濃縮液中加入無水乙醇，混勻，使乙醇終濃度為60%，置于4℃冰箱中， 醇沉 12 h后， 5 000 r·min－1離心 20 min， 棄去上清，取沉淀，用80%的乙醇洗滌3次～4次，于60℃烘干，即得多糖樣品。用50 mL蒸餾水溶解，將樣品適當(dāng)稀釋后，用苯酚－硫酸法在490 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多糖含量，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量[8]

抗疲勞實(shí)驗(yàn)分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠；

常壓缺氧實(shí)驗(yàn)分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠；

亞硝酸鈉毒性實(shí)驗(yàn)分為對照組、桑黃多糖低劑量組和桑黃多糖高劑量組，每組10只小鼠。給藥劑量見表1。

1.3.3 小鼠飼養(yǎng)及生長觀察

表1 灌胃方式和劑量

小鼠購回后適應(yīng)飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前，選取100只鼠齡一致、體重和形態(tài)較為接近的雄性小鼠，按照體重不同分為3個組別，并保證每組的個體體重偏差在±2 g內(nèi)。小鼠飼養(yǎng)采用自由攝食、飲水。每7天稱量一次小鼠體重，記錄小鼠體重變化[9]。

1.3.4 抗疲勞負(fù)重比選擇實(shí)驗(yàn)

小鼠游泳實(shí)驗(yàn)對水溫和室溫要求都較高，在游泳時要保證水溫恒定，室溫與游泳水溫差值應(yīng)在±2℃內(nèi)。小鼠的負(fù)重比例也是影響實(shí)驗(yàn)效果的重要因素，在正式實(shí)驗(yàn)之前，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，對小鼠在一定水溫、室溫和負(fù)重情況下的游泳實(shí)驗(yàn)有一定把握，以選擇效果差異較大且合理的負(fù)重比。因此，設(shè)計4個負(fù)重比，分別為3%、5%、7%、10%。

1.3.5 抗疲勞各指標(biāo)的測定方法

小鼠力竭游泳時間的測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，負(fù)重游泳，負(fù)重物為小鼠體重5%的鉛皮，水深35 cm，水溫 (25±1)℃。輕輕攪動水面使小鼠不停游動，并打散小鼠毛發(fā)上的氣泡。記錄小鼠從入水至力竭時的游泳時間，小鼠頭部入水7 s不上浮時，判定其游泳運(yùn)動已至力竭。

肝糖原測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，不負(fù)重游泳。1 h后停止游泳，立即殺死小鼠，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，按照肝糖原測試盒說明方法，測定肝糖原含量[10]。

血清乳酸含量的測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，負(fù)重4%鉛皮游泳。游泳前、游泳后和游泳后30 min分別采血，血樣離心后按照乳酸 （Lactic Acid LD）測試盒說明方法測定血清乳酸含量。

血清尿素氮含量測定：小鼠末次灌胃給藥1 h后，不負(fù)重游泳1 h后停止游泳，小鼠休息1 h后采血，血樣離心后按照尿素氮 （BUN）測試盒說明方法測血清尿素氮含量 [11－12]。

1.3.6 耐缺氧實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)的測定方法

常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)：末次灌胃給藥1 h后，將各組小鼠分別放入盛有10 g鈉石灰的125 mL廣口瓶中，每瓶1只，涂抹凡士林瓶蓋封口，計時，以呼吸停止為計時終止指標(biāo)[13]。

亞硝酸鈉毒性實(shí)驗(yàn)：末次灌胃給藥1 h后，稱量小鼠體重， 將每只小鼠以 200/mg·kg－1·bw－1的劑量 i.p.亞硝酸鈉，記錄小鼠從給藥到死亡的存活時間[14－15]。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件對各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃多糖對小鼠體重增重的影響

桑黃多糖對小鼠體重的影響見表2。

表2 桑黃多糖對小鼠體重的影響 （x±s，n=10）

經(jīng)過30 d的桑黃多糖灌胃，高劑量和低劑量多糖灌胃組的小鼠體重與對照組相比，明顯增加，且呈顯著性差異 （P＜0.01， P＜0.05）。 增重與多糖灌胃劑量呈現(xiàn)出正向劑量關(guān)系，灌胃桑黃多糖高劑量的小鼠平均體重增重量為15.48 g， 高于低劑量的增重量 14.67 g。

2.2 抗疲勞實(shí)驗(yàn)

負(fù)重游泳各項(xiàng)指標(biāo) （時間長短，糖原，血乳酸以及血清尿素氮的變化）是機(jī)體運(yùn)動耐力的體現(xiàn)，直接表明機(jī)體的疲勞情況與抗疲勞能力[16－17]。

2.2.1 小鼠負(fù)重游泳負(fù)重比的選擇

小鼠負(fù)重游泳負(fù)重比選擇結(jié)果見表3。

表3 小鼠游泳負(fù)重比的選擇結(jié)果 （X±s，n=10）

從表3可以看出，在室溫和水溫相同的情況下，不同的負(fù)重比對小鼠的游泳時間長短有很大的影響。負(fù)重比為3%、7%和10%時，各組小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的差異，這可能是3%的負(fù)重比過輕，對小鼠自身機(jī)能沒有明顯影響，而7%、10%的負(fù)重比過重，大大影響了灌胃小鼠的自身機(jī)能。結(jié)果表明，在選用負(fù)重比為5%時，對照組和灌糖組表現(xiàn)出的差異性最為明顯。因此，后期的負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)選用5%的負(fù)重比。

2.2.2 桑黃多糖對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

運(yùn)動耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)，游泳時間的長短可以反應(yīng)動物運(yùn)動疲勞的程度。桑黃多糖對小鼠負(fù)重游泳時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

從表4可以看出，低劑量和高劑量的桑黃多糖灌胃組與生理鹽水灌胃組相比，小鼠的游泳時間明顯延長，且低劑量組的效果不如高劑量組明顯。高劑量組與對照組相比， 游泳時間明顯延長， 差異顯著 （P＜0.01， P＜0.05）， 而低劑量組的時間也有延長，差異較顯著 （P＜0.05）。因此，桑黃多糖尤其是高劑量可以明顯延長小鼠的游泳時間，增加率達(dá)70.62%，即增強(qiáng)小鼠的抗疲勞性，對小鼠的疲勞有顯著的拮抗作用。

表4 桑黃多糖對小鼠負(fù)重游泳的影響 （x±s，n=10）

2.2.3 桑黃多糖對小鼠游泳后肝糖原含量的影響。

表5 桑黃多糖對小鼠游泳后肝糖原含量的影響 （x±s，n=10）

從表5可以看出，低劑量和高劑量的桑黃多糖組與生理鹽水組相比，小鼠長時間游泳后的肝糖原儲備量增加，差異達(dá)到極顯著 （P＜0.01， P＜0.05）。 低劑量組的作用效果比高劑量組的更為明顯，肝糖原儲備量提高33.36%。因此，桑黃多糖能夠增加小鼠的肝糖原儲備量，具有顯著增強(qiáng)小鼠抗疲勞體質(zhì)的作用，但多糖的量效關(guān)系，并非隨劑量的增加而增強(qiáng)。

2.2.4 桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量的影響

桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量的影響結(jié)果見表6。

從表6可以看出，與對照組相比，各劑量組小鼠游泳前血乳酸的差異不顯著 （P＞0.05）；各劑量組小鼠游泳后0min血乳酸含量均低于對照組，差異具有顯著性 （P＜0.05，P＜0.01）；在休息20 min后，高劑量組小鼠游泳后20 min血乳酸含量低于對照組，且均差異極顯著 （P＜0.01）；低劑量組和高劑量小鼠三個時間點(diǎn)的血乳酸曲線下面積都低于對照組，差異均達(dá)到了極顯著 （P＜0.01），且高劑量組曲線下面積最小為211.61，相比對照組面積減小22.89%。因此，桑黃多糖能夠降低小鼠劇烈運(yùn)動后的血乳酸含量，具有顯著的抗疲勞作用。

表6 桑黃多糖對小鼠游泳后血清乳酸含量變化的影響 （x±s，n=10）

2.2.5 桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響

桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響結(jié)果見表7。

表7 桑黃多糖對小鼠游泳后血清尿素氮含量的影響 （x±s，n=10）

從表7可以看出，小鼠經(jīng)長時間的游泳，低劑量和高劑量桑黃多糖組的小鼠血清尿素氮含量與生理鹽水組相比， 顯著降低 (P＜0.01， P＜0.05)， 其中， 高劑量組血清尿素氮含量降低較為明顯， 為 7.33 mmol·L－1比對照組降低23.17%。因此，桑黃多糖能夠降低小鼠劇烈運(yùn)動后的血清尿素氮含量，減輕小鼠運(yùn)動后的生理負(fù)荷，對小鼠的疲勞有顯著的拮抗作用。

2.3 耐缺氧實(shí)驗(yàn)

耐缺氧能力是間接反映抗疲勞能力的一組指標(biāo)。疲勞的過程中，往往伴隨著組織缺氧，若機(jī)體攜氧、利用氧的能力強(qiáng)，就能產(chǎn)生更多的能量，同時減少無氧酵解產(chǎn)生的乳酸，延緩疲勞現(xiàn)象的出現(xiàn)。

常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)是一種以測定小鼠缺氧存活時間為觀測指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方法，常用于評價抗缺氧作用。亞硝酸鈉會使正常2價鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)?價鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧，并表現(xiàn)出相應(yīng)的缺氧癥狀。本研究通過常壓缺氧以及注射亞硝酸鈉，考察服用桑黃多糖的小鼠耐缺氧能力[18－19]。

2.3.1 桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧能力的影響

桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧時間影響見表8。

從表8可以看出，低劑量組的小鼠常壓耐缺氧時間為32.18 min， 明顯高于對照組的 22.65 min， 存活時間提高42.08%且差異顯著 （P＜0.01， P＜0.05）， 同時也高于高劑量組的23.58 min。而高劑量組與對照組的差異也較明顯（P＜0.05），低劑量組的耐缺氧時間明顯高于高劑量組。因此，低劑量的桑黃多糖能顯著提高小鼠的常壓耐缺氧能力，增強(qiáng)小鼠體質(zhì)。

表8 桑黃多糖對小鼠常壓耐缺氧時間的影響 （x±s，n=10）

2.3.2 桑黃多糖對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的影響

桑黃多糖對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 桑黃多糖對小鼠亞硝酸鈉毒性存活時間的影響 （x±s，n=10）

從表9可以看出，對照組的小鼠注射亞硝酸鈉后存活時間為12.78 min，而采用低劑量和高劑量的桑黃多糖灌胃的小鼠存活時間分別為 15.21 min、 15.68 min， 明顯高于對照組的結(jié)果，高劑量較對照延長35.29%(顯著性P＜0.01， P＜0.05)。 同時， 低劑量和高劑量組的小鼠存活時間沒有明顯差異。因此，桑黃多糖能夠顯著提高小鼠耐亞硝酸鈉毒性的能力，增強(qiáng)其體質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

20世紀(jì)70年代以來，藥用真菌多糖的研究開發(fā)進(jìn)入了一個嶄新的發(fā)展時期。這些藥用真菌多糖的研究主要集中在靈芝，蟲草等一些常見真菌，對桑黃多糖的抗疲勞活性研究還尚少。

桑黃菌絲體經(jīng)熱水浸提、乙醇沉淀去除小分子量糖分，得到分子量較大的桑黃菌絲體粗多糖，與文獻(xiàn)報道的活性桑黃多糖分子量范圍相符，本文對其進(jìn)行了進(jìn)一步活性研究。

疲勞是一個綜合性的生理過程，涉及了很多的生理和生化因素，它是人體腦力活動或者體力活動達(dá)到一定階段時，機(jī)體必定會表現(xiàn)出的一種正常的生理現(xiàn)象，疲勞既是機(jī)體原有的工作能力暫時下降的表現(xiàn)，又是機(jī)體可能發(fā)展到傷病狀態(tài)的一個先兆[5,10,11]。灌胃桑黃多糖抗疲勞實(shí)驗(yàn)表明，低、高劑量組小鼠的游泳實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于生理鹽水組，即桑黃多糖對有關(guān)疲勞的生化指標(biāo)有著積極的影響，可以提升機(jī)體的運(yùn)動耐力，具有抗疲勞作用；同時灌胃劑量的高低對抗疲勞的作用效果也有差異，以上結(jié)果顯示出在一定劑量范圍內(nèi)，桑黃多糖劑量越高，抗疲勞功效越顯著。

缺氧對機(jī)體是一種緊張性刺激，影響機(jī)體各種代謝，特別是影響機(jī)體的氧化功能，最終會導(dǎo)致機(jī)體的心、腦等主要器官缺氧供給不足而死亡[9,12,16]。灌胃桑黃多糖耐缺氧實(shí)驗(yàn)表明，桑黃多糖能顯著延長小鼠常壓耐缺氧條件下的存活時間，同時減少機(jī)體受亞硝酸鈉毒性影響，增加血液攜氧能力，清除血液中的自由基，從而延長小鼠的喘氣時間，提高小鼠對缺氧的耐受能力，同時灌胃劑量的差異對常壓耐缺氧也有不同的效果，低劑量的桑黃多糖能顯著提高小鼠的常壓耐缺氧能力，但是劑量高低對小鼠耐亞硝酸鈉毒性的能力沒有明顯差異。然而，桑黃活性多糖的成分及其深層的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，桑黃多糖可以提高小鼠的抗疲勞和耐缺氧能力，從而可為桑黃走向保健品、藥品市場提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。隨著桑黃菌絲體規(guī)?；a(chǎn)的實(shí)現(xiàn)，與之相關(guān)的生物產(chǎn)品，在職業(yè)疲勞人群和老年人群中必將具有廣闊的市場前景。

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