PI3K蛋白和mRNA在鼻咽癌組織中的表達及意義

齊 巖，黃 波，蘭桂萍，張名霞，嚴(yán) 波，王振霖，張秋航＊

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，北京100053；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸腫瘤科，廣西 南寧530021）

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于鼻咽部上皮組織的一種惡性腫瘤，具有顯著的種族及地區(qū)聚集性和復(fù)雜的病因?qū)W，其病因尚未完全明了，發(fā)生部位隱蔽，又與周圍重要器宮毗鄰，具有易于向鄰近器官直接浸潤或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為，癥狀隱蔽且多變，早期常被誤診。鼻咽癌生物學(xué)行為最大的特點就是易轉(zhuǎn)移，其頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率達到75%以上［1］。且轉(zhuǎn)移在發(fā)病早期即有發(fā)生，45%－50%的患者是以頸部腫塊為首發(fā)癥狀就診的［2］。這一特點嚴(yán)重影響了鼻咽癌患者的預(yù)后。盡管近年來診斷手段、放射治療設(shè)備和技術(shù)的不斷更新，但其該病的5年總生存率仍徘徊于50%－60%［3］。因此，尋找鼻咽癌相關(guān)特別是與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物以判斷其生物學(xué)特性和預(yù)后，尋找臨床治療有效的分子靶向，對積極診斷、治療惡性腫瘤，提高鼻咽癌患者的生活質(zhì)量，延長生存時間都具有重要意義。PI3K是與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。本研究首次在核酸水平檢測PI3K在鼻咽癌組織中的表達水平并探討其信號分子與鼻咽癌臨床特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有組織標(biāo)本均來自2003年9月至2004年9月于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科二區(qū)門診就診的病人，共102例，所有患者初診時經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，均未經(jīng)治療。20例對照組為門診要求體檢的正常人群鼻咽部活檢組織，病理診斷均鼻咽正常上皮組織。經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會通過，所有參與實驗的患者均簽署知情同意書。組織標(biāo)本活檢后生理鹽水沖洗潔凈分為兩部分，其中一部分在活檢后10min內(nèi)置入液氮內(nèi)，取其中28例隨后放入－80℃冰箱保存用于Q－RT－PCR；另一部分置于10%中性福爾馬林液中固定用于免疫組化。

1.2 試劑與方法

1.2.1 免疫組化的試劑為PI3K鼠抗人單克隆抗體（Cell Signaling＃4249工作濃度1∶75）。采用免疫組化方法，所有新鮮標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定，48小時內(nèi)取材，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，HE染色。采用鏈霉抗生物素蛋白－過氧化酶（SP）免疫組織化學(xué)染色方法檢測PI3K的表達。用PBS代替一抗作空白對照。用已知的肝癌組織的PI3K陽性切片作陽性對照。

1.2.2 QRT－PCR檢測 首先用 Trizol試劑一步法提取組織總RNA，進行重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備，使用AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大BBI公司）制備cDNA第一鏈，引物由上海生物工程技術(shù)公司合成，應(yīng)用GAPDH為內(nèi)參，基因引物序列及擴增片段如下表1，根據(jù)測得的A260值和重組質(zhì)粒的分子質(zhì)量換算成質(zhì)粒的拷貝濃度（copy／μl），將母液濃度調(diào)整至1×1011copy／μl作為原液，取部分原液作10倍系列稀釋成108－103copy／μl的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品。Chromo 4實時熒光定量PCR儀上擴增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃20s、58℃30s、讀板，40個循環(huán)。染料為SYBR GreenⅠ（BBI）反應(yīng)結(jié)束后，聯(lián)機生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。自動計算出曲線的斜率（slope），并根據(jù)公式E＝10［－1／slope］計算出擴增效率（1.0≤E≤2.0）。檢測引物和反應(yīng)條件按標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)完成得到的記錄點曲線，計算出臨界循環(huán)數(shù)（Ct值）。根據(jù)陳劍英［4］的方法，以GAPDH mRNA的量為內(nèi)參照，計算目的基因mRNA的相對量。計算公式為：

1.3 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照陳豐霖［5］等的方法：采用雙盲法，觀察切片至少5個以上具有代表性的高倍視野，不少于1000個細(xì)胞，對免疫組化結(jié)果進行評估［5］。根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進行分析評定：基本不著色為0分，著色淡為1分，著色較深為2分；著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率：≤5%為0分，6%－25%為1分，26%－50%為2分，≥51%為3分，以每張切片染色程度和染色細(xì)胞百分率得分相乘的積為最后得分。得0－1分者判為陰性（－），得2分者判為弱陽性（＋），得3－4分者判為中等陽性 （＋＋），5－6分者判為強陽性 （＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0分析軟件，免疫組化的數(shù)據(jù)采用χ2檢驗及四格表確切概率法。計量資料采用t檢驗，分類變量資料以相對數(shù)表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色顯示 SP法免疫組化染色所有切片染色背景清晰，陰性對照不著色。PI3K陽性反應(yīng)呈棕黃色，主要存在于細(xì)胞漿。

表1 PCR引物

2.2 102例鼻咽癌中，PI3K陽性表達86例（84.3%），染色呈棕褐色彌漫性分布。其中25例（24.5%）弱陽性表達，61例（59.8%）強陽性表達，陰性表達16例（15.7%），見表2、圖1。

圖1 A所示PI3K在鼻咽癌組織中的表達，PI3K陽性反應(yīng)呈棕黃色，主要存在于細(xì)胞漿，圖中標(biāo)尺代表50μm。B所示PI3K在鼻咽部正常上皮組織中的表達呈陰性，圖中標(biāo)尺代表75μm。

2.3 分析發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中PI3K表達與鼻咽部正常上皮組織相比有顯著差異，鼻咽正常上皮組PI3K表達顯著低于鼻咽癌組，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意（P＝0.013），見表2。

表2 PI3K在鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮中的表達

2.4 鼻咽癌中PI3K表達與臨床病理的關(guān)系

結(jié)合患者的臨床資料，反映PI3K表達率的臨床意義。我們看到PI3K與患者的年齡、性別均無關(guān)，而在分化程度、浸潤深度等臨床病理指標(biāo)之間的差異比較則顯示統(tǒng)計學(xué)意義非常顯著，見表3。

表3 鼻咽癌中PI3K表達與臨床病理的關(guān)系

2.5 在鼻咽癌組織中，PI3K的mRNA表達量明顯高于鼻咽部正常上皮組織組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.0424）見圖2。

圖2 Q－RT－PCR檢測PI3K的mRNA表達量

3 討論

目前的研究表明，PI3K是磷脂激酶家族中的一個重要成員［6］，有研究者在前列腺癌患者中發(fā)現(xiàn)多種生長因子（如胰島素樣生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子）及其受體可以刺激P I3K／mTOR信號通路的過表達［7］。此通路的活化在肝癌、肺癌、胰腺癌等許多腫瘤中均有報道［8］。還有研究表明，抑制PI3K通路可以提高對腫瘤細(xì)胞的放療與化療效果［9］。本論文以免疫組化SP法和Q－RT－PCR的方法分別從蛋白和mRNA水平來檢測鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中PI3K的表達，其在102例鼻咽癌組織中表達陽性率為84.3%，而對照組表達陽性率為30%。癌組織PI3K的陽性率遠(yuǎn)高于對照組，差異明顯（P＜0.05）。目前有學(xué)者通過免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)PI3K在鼻咽癌組織中的蛋白表達增高［10］，這與本文的結(jié)果相似。而本研究采用免疫組化和實時熒光定量PCR技術(shù)使得其結(jié)果更為準(zhǔn)確。在實時熒光定量PCR的結(jié)果中，我們觀察到PI3K量作為衡量表達水平的參數(shù)，鼻咽癌組織中PI3K的表達水平顯著升高，大多超過104數(shù)量級，可以定義為超表達。而其超表達與腫瘤的惡性表型、分化程度、浸潤深度都密切相關(guān)，并可能成為預(yù)測腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的依據(jù)之一。

而且，在對表2進行分析時，我們定義，（－）和（＋）為低水平表達，（＋＋）和（＋＋＋）為高水平表達，鼻咽癌標(biāo)本中PI3K的表達大多數(shù)屬于高水平表達。實際上，這與臨床資料也是非常吻合的。在本論文檢測和分析的102例患者中，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者達到90例之多，而只有12例沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的征象。

總的來說，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌PI3K的表達水平的改變表現(xiàn)下述特點：（1）表現(xiàn)為mRNA和蛋白表達增加；（2）PI3K表達水平與腫瘤的惡性表型相關(guān)，例如細(xì)胞低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；其高表達是與鼻咽癌惡性表型相關(guān)的重要指標(biāo)，它們的高表達可以作為判斷鼻咽癌患者腫瘤惡性程度的必要參考指標(biāo)。

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