香菇多糖增強5－FU抑制結腸癌細胞增殖機制研究

袁昌勁，孔慶志，盧宏達，孔雙喜

（1.武漢市中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢430014；2.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院 腫瘤科）

香菇多糖主要為甘露糖甘肽，其余為多種糖分和各種氨基酸等，對光和熱穩(wěn)定，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機溶劑［1］，聯(lián)合抗腫瘤藥物對胃癌［2］、結腸癌［3］、肺癌［4］等腫瘤具有良好的療效，顯著延長腫瘤患者存活時間。目前對香菇多糖的抗腫瘤機制仍然不清楚，一般認為和免疫調節(jié)有關。香菇多糖是典型的T細胞激活劑，體內外均能促進細胞毒T淋巴細胞（CTL）的產(chǎn)生，提高CTL細胞殺傷力，增強正?；蛎庖吖δ艿拖滦∈蟮倪t發(fā)型超敏反應，提高抗體依賴性細胞毒作用，同時能結合到人單核細胞上激活內源性信號傳導通路［5，6］。本文應用香菇多糖及5－FU處理SW480結腸癌細胞，探討其對細胞增殖和凋亡的影響，并研究其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SW480結腸癌細胞購于美國ATCC，RPMI－1640、雙抗和FBS購于Gibco公司，MTT試劑購于Sigma公司，RNA 提取和 RT－PCR試劑盒購于Takara公司，引物由上海生工公司合成，香菇多糖采用南京康海藥業(yè)有限公司的香菇多糖凍干粉劑，5－FU購于Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理

SW480結腸癌細胞完全培養(yǎng)基為10%FBS、89%RPMI－1640和1%雙抗，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，實驗時取對數(shù)生長期細胞。香菇多糖凍干粉劑用生理鹽水配制成5μmol／ml，5－FU用生理鹽水配制成500mg／L存儲液，根據(jù)王峻［7］和Harada［8］等研究，使用時加入完全培養(yǎng)基配制如下濃度工作液①Len組：Lentinan終濃度0.05 μmol／ml；②FU組：5－FU終濃度100mg／L；③L＋F組：Lentinan終濃度0.05μmol／ml和100mg／L 5－FU終濃度。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

每孔1000個細胞接種于96孔板，每孔200μl，加入工作液處理24h后，PBS洗滌3次更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天MTT法檢測一孔，每孔加入5 mg／ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h后棄去，加入DMSO 50μl，振蕩15min充分溶解結晶，酶標檢測儀上測定波長為490nm下的吸光值（A值），每孔細胞吸光度＝測得值－空白對照孔值。以吸光值為縱坐標，以時間（天）為橫坐標，繪制Len組、FU組、L＋F組和正常未處理組SW480結腸癌細胞增殖曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡

藥物處理24h后收集細胞并離心，細胞沉淀用PBS洗滌，加入標記有異硫氰酸熒光素的連接素Annexin V－FITC和碘化丙錠，避光孵育15min后檢測細胞凋亡，另制成200μl細胞懸液，加入70%的冰乙醇5ml－20℃固定24h以上，加入RNase A 200μl，37℃溫育30min，加入碘化丙啶至終濃度50mg／L，檢測細胞周期。增殖指數(shù)（PI）＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 RT－PCR檢測多藥耐藥基因 MDR1、MRP1和LRP表達

按照RNA提取試劑盒說明提取細胞總RNA，用β－actin作為內參照進行RT－PCR擴增，引物序列參見表1。PCR反應體系為25μl，反應參數(shù)：94℃預變性5min，94℃變性45s，表1基因對應退火溫度退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)，最后一輪72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20g／L瓊脂糖凝膠電泳后檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS12.0進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。采用t檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SW480結腸癌細胞增殖

正常對照組SW480結腸癌細胞表現(xiàn)為對數(shù)增殖狀態(tài)，單獨5－FU處理后，增殖速度較對照組顯著降低，增殖速度降低，細胞增殖受到抑制；單獨香菇多糖對細胞增殖無明顯影響，聯(lián)合5－FU作用后的細胞增殖速度顯著降低（圖1）。

表1 MDR1、MRP1和LRP基因RT－PCR反應序列和退火溫度

2.2 細胞形態(tài)與凋亡

鏡下觀察，F(xiàn)U組SW480結腸癌細胞體積縮小、死亡，細胞密度較對照組降低；Len組結腸癌細胞無明顯細胞體積縮小和死亡，細胞密度和對照組無明顯區(qū)別；香菇多糖聯(lián)合5－FU處理后，死亡細胞增加，細胞密度較對照組顯著降低，明顯低于FU組。Len組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），F(xiàn)U組G0／G1期細胞明顯增加，S期細胞降低，PI明顯降低，細胞凋亡率顯著提高（P＜0.05），L＋F組與FU組和對照組相比，細胞凋亡率顯著增加，PI降低，細胞停滯于G0／G1期，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

圖1 SW480結腸癌細胞增殖曲線

表2 SW480結腸癌細胞細胞周期與凋亡（±s）

表2 SW480結腸癌細胞細胞周期與凋亡（±s）

與對照組相比，＊P＜0.05，＃P＞0.05；a、b和c之間，P＜0.05

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2.3 RT－PCR檢測耐藥基因表達

正常對照組SW480結腸癌細胞均可檢測到MDR1、MRP1和LRP基因mRNA表達，加入5－FU藥物處理后，MDR1基因表達增加，MRP1和LRP基因表達無明顯變化。香菇多糖能顯著降低MDR1和MRP1基因表達，而對LRP表達無影響。香菇多糖聯(lián)合5－FU抑制MDR1和MRP1基因表達，表達呈缺失狀態(tài)，而對LRP基因表達無影響（圖2、圖3和圖4）。

3 討論

圖2 MDR1基因mRNA表達

圖3 MRP1基因mRNA表達

圖4 LRP基因mRNA表達

接受化療的患者在初次或再次接受化療時可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，藥物敏感度低于正常人。目前認為腫瘤細胞的耐藥主要和誘導表達多藥耐藥基因相關，多藥耐藥基因主要包括MDR1、MRP1和LRP［9］。MDR1基因編碼產(chǎn)物P－糖蛋白位于細胞膜，由兩個完全相同的單體結構構成每個單體有一個ATP結合位點，跨膜區(qū)域構成藥物通道盒式結構，ATP結合位點與能量供應有關，P－糖蛋白利用ATP水解功能將抗腫瘤藥物泵出胞膜外［10］。MRP1基因編碼的多藥耐藥相關蛋白1屬于非P－gp跨膜糖蛋白ATP依賴泵，能將帶負電荷的藥物分子逆濃度泵出到胞外，減少胞內藥物濃度，還可改變細胞漿及細胞器的pH值，使藥物到達作用部位的靶位點時濃度減少，避免藥物與靶點結合，直接參與腫瘤的轉移［11］。LRP廣泛分布于正常組織，使順鉑不能通過核孔進入細胞核，阻止以胞核為效應點的藥物轉運到胞漿中；將進入胞漿的藥物轉運到運輸囊泡中，起隔絕藥物作用，最終通過胞吐的方式到細胞外，主要介導烷化劑的耐藥［12］。目前研究表明，人工抑制多藥耐藥基因表達能顯著改善耐藥現(xiàn)象，提高化療藥物的療效。

5－FU為細胞周期特異性藥，主要抑制S期細胞。在體內轉變?yōu)?－氟－2－脫氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账岫种艱NA的生物合成。研究表明，梯度5－FU濃度刺激導致細胞多藥耐藥基因表達增加，利用該機制已經(jīng)成功制備5－FU耐藥細胞株［13，14］。本研究表明 5－FU 接觸 SW480結腸癌細胞后，MDR1表達增加，該現(xiàn)象與Theile等［15］研究一致。香菇多糖能顯著降低 MDR1和MRP1基因表達，而對LRP表達無影響，其具體作用機制有待進一步研究。

5－FU為S周期特異性抑制劑，抑制細胞進入有絲分裂器，本研究也證實該現(xiàn)象。5－FU聯(lián)合香菇多糖后，細胞仍然表現(xiàn)為停滯于G0／G1期特點，表明香菇多糖并沒有改變5－FU作用特點，但細胞增殖速度明顯降低，凋亡增加，我們推測是香菇多糖增加了SW480結腸癌細胞對5－FU的敏感性。香菇多糖能顯著降低多藥耐藥基因表達，正是該機制導致SW480對5－FU誘導耐藥作用減少，從而增加了細胞對5－FU的敏感度，但兩者之間是否存在因果關系，有待進一步研究。

［1］趙 軍.香菇多糖聯(lián)合奧沙利鉑治療惡性胸腔積液療效觀察［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，26（14）：2631.

［2］Yoshino S，Watanabe S，Imano M，et al.Improvement of QOL and prognosis by treatment of superfine dispersed lentinan in patients with advanced gastric cancer［J］.Hepatogastroenterology，2010.57（97）：172.

［3］Ng ML，Yap AT.Inhibition of human colon carcinoma development by lentinan from shiitake mushrooms（Lentinus edodes）［J］.J Altern Complement Med，2002，8（5）：581.

［4］李志英，朱應群，張 平，等.香菇多糖聯(lián)合GP方案對晚期非小細胞肺癌的療效觀察［J］.實用醫(yī)學雜志，2009，25（20）：3480.

［5］Zhou LD，Zhang QH，Zhang Y，et al.The shiitake mushroom－derived immuno－stimulant lentinan protects against murine malaria blood－stage infection by evoking adaptive immune－responses［J］.Int Immunopharmacol，2009.9（4）：455.

［6］龐志東，李文鋒.DC聯(lián)合香菇多糖激活TIL體外抗小鼠肝癌研究［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2009，26（6）：909.

［7］王 峻，周智東，夏大靜.香菇多糖增強樹突狀細胞瘤苗的抗腫瘤作用及其機制研究［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2007，27（1）：60.

［8］Harada K，Itashiki Y，Takenawa T，et al.Effects of lentinan alone and in combination with fluoropyrimidine anticancer agent on growth of human oral squamous cell carcinoma in vitro and in vivo［J］.Int J Oncol，2010，37（3）：623.

［9］Perez－Sayans M，Somoza－Martin JM，Barros－Angueira F，et al.Multidrug resistance in oral squamous cell carcinoma：The role of vacuolar ATPases［J］.Cancer Lett，2010，295（2）：135.

［10］Susa M，Iyer AK，Ryu K，et al.Inhibition of ABCB1（MDR1）expression by an siRNA nanoparticulate delivery system to overcome drug resistance in osteosarcoma［J］.PLoS ONE，2010，5（5）：e10764.

［11］Donmez Y，Akhmetova L，Iseri OD，et al.Effect of MDR modulators verapamil and promethazine on gene expression levels of MDR1and MRP1in doxorubicin－resistant MCF－7cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，145.

［12］El－Sharnouby JA，Abou El－Enein AM，Ghannam EI，et al.Expression of lung resistance protein and multidrug resistance－related protein（MRP1）in pediatric acute lymphoblastic leukemia［J］.J Oncol Pharm Pract，2010，16（3）：179.

［13］Tentes IK，Schmidt WM，Krupitza G，et al.Long－term persistence of acquired resistance to 5－fluorouracil in the colon cancer cell line SW620［J］.Exp Cell Res，2010，316（19）：3172.

［14］Zhou Y，Ling XL，Li SW，et al.Establishment of a human hepatoma multidrug resistant cell line in vitro［J］.World J Gastroenterol，2010，16（18）：2291.

［15］Theile D，Ketabi－Kiyanvash N，Herold－Mende C，et al.Evaluation of drug transporters＇significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma（Head Neck，2010）1031.