大鼠胰島素抵抗形成中脂聯(lián)素受體基因表達及運動的影響*

李 蕾，李之俊

(1.淮北師范大學體育學院，安徽 淮北 235000;2.上海體育科學研究所，上海 200030)

經(jīng)常進行有氧運動能夠增強機體糖脂代謝能力，提高與能量代謝相關的細胞核轉錄因子的活性以及機體對胰島素的敏感性，預防胰島素抵抗(insulin resistant，IR)的發(fā)生[1]。脂聯(lián)素是目前脂肪因子中唯一與體脂含量負相關，具有保護作用的因子，通過脂聯(lián)素受體的介導參與體內糖脂代謝調節(jié)、能量代謝、抗炎和抗動脈粥樣硬化等生物學效應。因此，有氧運動是否通過影響脂聯(lián)素受體表達而增強胰島素敏感性?目前運動對脂聯(lián)素受體基因水平影響的研究較少，且結論很不一致。本實驗旨在通過觀察高脂膳食和運動條件下SD大鼠骨骼肌和肝臟脂聯(lián)素受體基因表達的變化，以探討脂聯(lián)素受體在運動延緩大鼠IR形成中發(fā)揮的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及運動干預方案[2]

SD純系7周齡雄性大鼠46只，體重 180～200g，SPF級。分為4組(n=12):普食對照組(C組)、普食運動組(E組)、高脂膳食對照組(H組)、高脂膳食運動組(HE組)。

普通飼料適應性喂養(yǎng)一周后，C組和E組繼續(xù)普食喂養(yǎng)，H組和HE組改高脂飼料喂養(yǎng)。同時E組和HE組開始進行無負重游泳訓練。方案采用Ploug等報道的方法，水溫(33±2)℃，水深50cm，保證每只大鼠有 200cm2的活動面積以保證持續(xù)運動。第一周30min/d，第二周 30～60min/d，第三周60～90min/d，第四周維持90min/d直至實驗末。每周5天，共持續(xù)10周。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 運動組末次運動結束48 h后，再禁食12 h(即末次運動后60h采集標本)，以10%水合氯醛按40～45 mg/kg bw腹腔內麻醉后，將大鼠仰臥位固定于大鼠手術臺上，逐層打開腹腔，于下腔靜脈取血6 ml左右，靜置后離心取血清，-20℃保存。隨后迅速取整肝，取雙側大腿紅色股四頭肌，迅速投液氮，后裝入-80℃冰箱凍存，待測肝臟和骨骼肌脂聯(lián)素受體的基因表達情況。

1.2.2 測試指標

1.2.2.1 大鼠骨骼肌AdipoR1/R2 mRNA實時熒光定量PCR檢測

1.2.2.2 大鼠肝臟AdipoR1/R2 mRNA實時熒光定量PCR檢測 取大鼠骨骼肌(肝臟)組織200mg，于液氮中迅速研磨至粉末狀，每50mg加入1ml Trizol充分快速勻漿，經(jīng)過分相和沉淀，抽提總R NA。瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計觀察條帶完整性，測定OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。使用Promega，Madison，WI提供的逆轉錄試劑盒，取 RNA 2 ug進行逆轉錄。于GenBank上查找大鼠脂聯(lián)素受體和GAPDH的基因序列，Realtime PCR引物由ABI公司 Primer Express 3.0軟件設計，由上海英駿生物技術有限公司合成。進行后續(xù)的熒光定量PCR。AdipoR1的引物序列為:上游 5′-GCTGGCCTTTATGCTGCTCG-3′，下 游 5′-TCTAGGCCGTAACGGAATTC-3′。AdipoR2的引物序列為:上游 5′-CCCTCTGCAAGAGAAAGTGG-3′，下游 5′-TAGCCAGCCTATCTGCCCTA-3′。 GAPDH 內參的引物序列為 :上游 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。取上述cDNA樣品按 5倍稀釋，依次加入 SYBR GREEN5μl，上下游引物各 1 ul，ddH202.5μl，總反應體系為10μl，輕彈管底將溶液混合，5000r/min短暫離心。反應溫度程序60℃2min，95℃10min，接著40個循環(huán)(95℃15 s，60℃1 min)。所有樣品應用GAPDH作內參。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 AdipoR1/R2分布的實時熒光定量PCR檢測

對C組大鼠的檢測結果表明，AdipoR1 mRNA以股四頭肌表達較為豐富，與肝臟表達比較，差異有顯著性(P＜0.05，表1)。AdipoR2 mRNA在肝臟高表達，與股四頭肌表達比較，差異有顯著性(P＜0.05，表1)。

Tab.1 Distributions of adiponectin receptors in normal rats(，n=10-12)

Tab.1 Distributions of adiponectin receptors in normal rats(，n=10-12)

AdipoR:Adiponectin receptor*P＜0.05 vs liver;#P＜0.05 vs skeletal muscle

Receptor types AdipoR mRNA expression Skeletal muscle Liver AdipoR1 4.45±0.54* 3.21±0.76 AdipoR2 3.02±0.91 4.11±0.51#

2.2 骨骼肌 AdipoR1、肝臟AdipoR2 mRNA表達的實時熒光定量PCR檢測

大鼠紅色股四頭肌AdipoR1 mRNA表達量以C組最高，HE組最低。肝臟AdipoR2 mRNA表達量以C組最高，H組最低。其中，H組股四頭肌AdipoR1 mRNA、肝臟AdipoR2 mRNA表達顯著低于 C組(P＜0.05，表 2)，兩運動組(E組和HE組)均與同類安靜組水平相當(P＞0.05，表2)。

Tab.2 Expression of adiponectin receptor1 in skeletal muscle and adiponectin receptor 2 in liver(，n=10-12)

Tab.2 Expression of adiponectin receptor1 in skeletal muscle and adiponectin receptor 2 in liver(，n=10-12)

C:Normal dietary control group;E:Normal dietary exercise group;H:High fat dietary control group;HE:High fat dietary exercise group;AdipoR1:Adiponectin receptor1;AdipoR2:Adiponectin receptor 2*P＜0.05 vs C group

Group AdipoR1 AdipoR2 C 3.71±0.20 3.8±0.38 E 3.42±0.17 3.5±0.19 H 3.01±0.16* 2.81±0.13*HE 2.78±0.12 2.91±0.10

3 討論

2003年2月Yamauchi T成功克隆出人與小鼠脂聯(lián)素受體基因，分別定義為AdipoR1和AdipoR2。人與小鼠AdipoR1和R2均有95%以上同源性。受體與脂聯(lián)素的親和力同脂聯(lián)素敏感性密切相關。研究表明，AdipoR1所調節(jié)的脂肪酸氧化作用對球形脂聯(lián)素高度敏感，而抵抗全長脂聯(lián)素的作用。AdipoR2主要表達于肝臟，同時為兩種脂聯(lián)素的中等結合力受體。目前對脂聯(lián)素受體分布的研究只限于人和小鼠及Wistar大鼠，尚缺乏對SD大鼠的研究報道。本實驗中，肝臟和股四頭肌AdipoR1、R2均有表達，股四頭肌以AdipoR1高表達，肝臟以AdipoR2高表達。這與龔燕平、Yamauchi等研究結果一致。不同種類脂聯(lián)素受體分布的不同可能是脂聯(lián)素對各器官特異性作用的基礎。骨骼肌AdipoR1高表達和肝臟AdipoR2高表達，保證了脂聯(lián)素可以準確通過不同受體發(fā)揮其反饋調節(jié)或改善代謝的作用。

Yamauchi等用脂聯(lián)素及其受體1作用 C2C12肌細胞，發(fā)現(xiàn)AMPK及ACC磷酸化增加，說明脂聯(lián)素通過與AdipoR1結合后，活化AMPK進而在肌細胞發(fā)揮生物學作用。AdipoR2主要表達于肝臟，故認為AdipoR2是調節(jié)肝臟脂聯(lián)素敏感性的主要受體，其表達改變主要影響肝糖輸出和胰島素敏感性。A.E.Civitarese及Tauchida等研究顯示，AdipoR1和R2基因表達水平與胰島素敏感指數(shù)(ISI)顯著正相關，而與空腹胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)顯著負相關，有力支持了兩種受體在調節(jié)胰島素敏感性上均起重要作用。本實驗中，大鼠紅色股四頭肌AdipoR1和肝臟AdipoR2mRNA表達有相似變化趨勢。即AdipoR1和R2 mRNA在ISI較高的C組表達顯著高于ISI較低的H組。這與Bullen JW等[3]對小鼠的研究結果一致。提示骨骼肌AdipoR1 mRNA表達和肝臟AdipoR2 mRNA表達的下調可能參與介導了高脂大鼠IR的形成。

近年來，急性和長期運動訓練對脂聯(lián)素受體基因水平表達影響的研究陸續(xù)有報道。CHANGSP[4]等研究耐力訓練對肥胖Zucker大鼠AdipoR表達影響的結果表明，骨骼肌AdipoR1低表達，瘦的對照組正常。HUANG H等研究耐力訓練對KKAy糖尿病小鼠AdipoR表達影響的結果表明，骨骼肌和肝臟AdipoR1表達升高，AdipoR2表達不變。另一項對健康Wistar大鼠耐力訓練后AdipoR表達變化的研究顯示，5 d/W低強度訓練，骨骼肌AdipoR1表達上升。以上研究結果一方面顯示出目前運動影響AdipoR的研究結果存在不確定結論，這可能與不同實驗采用的研究對象和運動干預方案不同有關，另一方面也提示了脂聯(lián)素受體的表達依賴于運動的強度、頻率和持續(xù)時間(只在一定的運動強度和持續(xù)時間很長的運動后才發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體基因表達的變化)。本實驗中，兩運動組AdipoR1和R2(E組和HE組)均與同類安靜組水平相當，未發(fā)現(xiàn)運動對脂聯(lián)素受體水平產(chǎn)生顯著性影響，可能與10周的游泳運動訓練時間不夠長有關。也有可能是運動過程中腎上腺素的釋放導致了一系列抑制修正效應。有研究報道，β激動劑降低了3T3-L1脂肪細胞中AdipomRNA的表達。大鼠運動1周后，未發(fā)現(xiàn)脂肪組織中Adipo mRNA表達增加，而腎上腺素水平卻顯著性的升高了，提示運動中腎上腺素的釋放可能抑制了Adipo mRNA的表達[5]。此外，以往對瘦素與運動關系的研究發(fā)現(xiàn)瘦素有延遲性變化，脂聯(lián)素也可能存在延遲性變化，提示今后可增加檢測點。運動能降低循環(huán)瘦素水平已得到較一致的認可，但是運動在能否升高脂聯(lián)素及其受體水平上則結論不太一致。瘦素和脂聯(lián)素可能存在交互作用:高瘦素水平可能抑制脂聯(lián)素及其受體發(fā)揮作用。因此，今后研究還應更加關注脂肪因子間的交互作用在運動改善胰島素敏感性中的作用。

[1]Hawley J A，Lessard S J.Exercise training-induced improvements in insulin action[J].Acta Physiol，2008，192(1):127-135.

[2]李 蕾，李之俊，魏安奎，等.胰島素抵抗動物模型和運動干預模型的建立與評價[J].武漢體育學院學報，2009，43(8):51-54.

[3]Bullen J W Jr，Bluher S，Kelesidis T，et al.Regulation of adiponectin and its receptor in response to development of diet-induced obesity in mice[J].Am J Physiol Endoc rinol Metab，2007，292(4):E1079-1086.

[4]Chang S P，Chen Y H，Chang W C，et al.Increase of adiponectin receptor gene expression by physical exercise in soleus muscle of obese Zucker rats[J].Eur J Appl Physiol，2006，97(2):189-195.

[5]Zeng Q，Isobe K，F(xiàn)u L，et al.Effects of exercise on adiponectin and adiponectin receptor levels in rats[J].Life Sci，2007，80(5):454-459.