骨骼肌和心肌缺血后處理對兔缺血/再灌注心肌的保護作用*

曹廣運,謝瑞芹,崔 煒,劉 凡,劉 靜,魯靜朝,任慧敏,呼海娟

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內(nèi)科,石家莊 055550)

冠心病是影響人們身體健康的重要疾病,其中急性心肌梗死是危及人們身體健康的重要原因之一。在急性心肌梗死病人中,無論是藥物溶栓還是經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)或冠脈搭橋,及時有效恢復(fù)灌注是挽救心肌的重要治療措施。然而再灌注治療卻不可避免的引起缺血/再灌注損傷。因此,如何減少心肌的缺血/再灌注損傷是目前研究的熱點。

近年來,人們對減少心肌缺血/再灌注損傷的方法進行了深入的研究,發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均是減少心肌缺血/再灌注損傷的有效方法,而缺血后適應(yīng)因其實用性和可操作性逐漸被學者所關(guān)注。

缺血后適應(yīng)又稱為缺血后處理,其包括心肌本身的缺血后適應(yīng)和其它器官對心肌的缺血后適應(yīng),也稱為遠端缺血后適應(yīng),如腎臟、小腸等的缺血后處理都可減少心肌的缺血/再灌注損傷[1]。在遠端器官中,骨骼肌以其對缺血的耐受性強和操作方便有可能成為心臟保護的首選器官。但骨骼肌缺血后處理和心肌的缺血后處理對心臟保護作用是否存在差異,以及兩者聯(lián)合后心臟保護作用是否可以疊加目前研究較少。本實驗預(yù)對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康新西蘭大白兔30只,雌雄不拘,體重2.5～3.0 kg。所有動物隨機分為5組(n=6):缺血對照組(Con)、假手術(shù)組(sham)、心肌缺血后處理組(myocardial ischemic postconditioning,MPostC)和肢體缺血后處理組(remote postconditioning,RPostC)及心肌缺血后處理聯(lián)合肢體缺血后處理組(MPostC+RPostC)。

1.2 模型制備

1.2.1 心肌缺血/再灌注模型制備 兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后固定于實驗臺上,氣管插管,連接小型動物呼吸機,以1 L/min的速度給予富含100%氧氣的氣體。心電圖機針形電極插于動物四肢皮下,分離左頸總動脈插管連接壓力換能器監(jiān)測血壓(BP)和心率(HR)。游離右頸總靜脈及雙側(cè)髂外動脈備用。

小止血鉗夾斷3、4肋軟骨,鈍性分離,鉗夾肋間內(nèi)、外肌止血。上、下緣游離出2.5 cm左右的縱行切口,剪開縱隔胸膜,露出心包,暴露心臟。并游離頸動脈備用。找出左冠狀動脈的旋支及左室支。眼科5-0針線縫扎左室支中點處(以左心耳到心尖連線的中點平面),以內(nèi)徑0.5 cm的硅膠管套線,束緊后緊貼硅膠管的上端用止血鉗夾緊線觀察:(1)心肌的顏色變化:由紅色變暗灰色。(2)結(jié)扎前、后心電圖改變 :Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高,為心肌缺血成功。松開套管后心肌顏色迅速恢復(fù)為原來紅色為心肌再灌注成功。

1.2.2 骨骼肌缺血/再灌注模型 采用2%利多卡因局麻雙側(cè)腹股溝區(qū),直視下分離雙側(cè)髂外動脈,動脈夾鉗夾固定部位阻斷遠端血流,通過結(jié)扎遠端動脈搏動的有無反映下肢血流的阻斷情況。

1.3 分組處理

缺血/再灌注模型制作成功,血流動力學穩(wěn)定10 min后按以下程序分組進行干預(yù)。(1)缺血對照組(Con):按如上步驟致使兔心肌持續(xù)缺血45 min,然后再灌注120 min。(2)假手術(shù)組(Sham):麻醉,暴露心臟,分離左室支,穿線但不接扎。(3)近端后處理組(MPostC):在心肌缺血末再灌注開始時,對結(jié)扎的左室支給予開通20 s-閉塞20 s,即R/I循環(huán)3次,后再灌注至 120 min。(4)遠端后處理組(RPostC):分離雙側(cè)髂外動脈,在心肌缺血末再灌注開始前12 min,用動脈夾夾閉雙側(cè)髂外動脈,行缺血5 min-開通1 min,即I/R循環(huán)2次,并于心肌再灌注時同時松開雙側(cè)髂外動脈,與心肌同時灌注至120 min。(5)近端后處理+遠端后處理組(MPostC+RPostC):心肌缺血45 min后分離雙側(cè)髂外動脈,在缺血末再灌注開始前12 min夾閉,行缺血5 min-開通1 min,即I/R循環(huán)2次,于心肌再灌注時同時松開夾閉的雙側(cè)髂外動脈,與心肌同時灌注至120 min。同時,在缺血末再灌注開始時,對結(jié)扎的左室支給予開通20 s-閉塞20 s,即R/I循環(huán)3次,后再灌注至120 min。

1.4 觀察指標

1.4.1血流動力學監(jiān)測 實驗時分離左頸總動脈插管連接壓力換能器與SMUP-PC1型生物信號處理系統(tǒng)相連,以biopac Systems AcqKnowledge軟件記錄血壓(blood pressure,BP)和心率(heart rate,HR)等血流動力學指標。

1.4.2 心肌梗死范圍測定 于再灌注末原位重新結(jié)扎左室支,從耳緣靜脈注入2%Evans藍3 ml～4 ml,2 min后剪下心臟,去除雙房及右室,-20℃冰凍,沿左心室(LV)長軸橫切為厚約2 mm的心肌8～9片,數(shù)碼相機連續(xù)拍照,分離缺血區(qū)和非缺血區(qū)。將缺血心肌置入TTC磷酸緩沖液中染色,數(shù)碼相機連續(xù)拍照,分離壞死區(qū)和非壞死區(qū)。以圖像處理軟件(Photoshop及image-Pro Plus圖像處理系統(tǒng)計算各部分面積。以缺血區(qū)面積/左室面積代表缺血區(qū)范圍;以壞死區(qū)面積/缺血區(qū)面積表示壞死區(qū)范圍。

1.4.3 心肌酶測定 分別于結(jié)扎冠脈前及缺血末、再灌注60 min及120 min時,從右頸動脈抽血2 ml,3 500 r/min,離心10 min,分離血清,-80℃保存待測。采用生化分析儀連續(xù)監(jiān)測法統(tǒng)一測定CPK及LDH含量,藥盒購于南京建成生物工程研究所,所有試劑均為分析純。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組血流動力學指標

從表1可看出,缺血前各組間心率(HR)和平均動脈壓(MAP)均無明顯差異(P＞0.05)。缺血期,各組MAP和HR亦無顯著差異(P＞0.05,表1,2)。這樣可以保證各組在相似的血流動力學狀態(tài)下行缺血/再灌注處理,不致因血流動力學不同而影響實驗結(jié)果。

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

Tab.1 Changes of HR in different groups(Beats/min,±s,n=6)

HR:Heart rate;Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 244.83±32.63 226.33±47.24 231.67±31.73 223.83±29.27 Sham 220.00±25.61 224.23±30.21 230.32±26.78 216.26±21.32 MPostC 210.00±58.99 226.67±16.33 206.67±12.11 206.67±20.66 RPostC 233.00±16.24 221.17±16.02 227.50±12.72 234.50±12.18 MPostC+RPostC 228.33±39.71 220.83±2.04 193.33±27.33 175.00±37.82

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

Tab.2 Changes of MAP in different groups(mmHg,±s,n=6)

MAP:Mean artery pressure;Con:Controlgroup;Sham:Sham operationgroup;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group

Group Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con 77.83±10.36 68.67±4.76 77.67±14.08 78.00±12.93 Sham 80.23±12.23 78.65±5.36 82.58±6.89 90.00±9.36 MPostC 104.83±34.76 92.67±40.63 88.00±24.65 92.00±28.20 RPostC 83.17±5.15 80.17±6.67 90.33±10.80 93.17±8.03 MPostC+RPostC 100.00±7.69 73.83±11.20 91.00±7.62 90.67±2.73

2.2 心肌缺血范圍和梗死范圍比較

各組實驗動物由結(jié)扎冠脈所造成的心肌缺血范圍(AAR/LV)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。除假手術(shù)組(Sham)外,各處理組與缺血對照組(Con)相比,壞死范圍(AN/AAR)明顯降低(P＜0.05)。近端后處理組(MPostC)及遠端后處理組(RPostC)之間心肌AN/AAR無明顯差異(P＞0.05)。但兩者聯(lián)合后AN/AAR值則明顯降低,與MPostC組及RPostC組分別相比有顯著性差異(P＜0.05,表3)。提示我們相對缺血對照組而言,除假手術(shù)組外,各組均對缺血/再灌注心肌具保護作用,而近端后處理和遠端后處理的保護作用可以疊加。

2.3 各組血漿CPK及LDH含量比較

對各組血漿CPK及LDH隨時間的變化趨勢作圖,可以看出CPK及LDH值在經(jīng)過處理后1H及2H變化趨勢較對照組而言明顯降低(表4)。其中CPK表現(xiàn)尤為典型,隨著再灌注時間的延長,缺血對照組CPK升高最明顯,近端后處理和遠端后處理組次之,兩者無統(tǒng)計學差異,而聯(lián)合處理組更次之,與心肌梗死范圍相對應(yīng)。

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Tab.3 Ratios of AAR/LV andAN/AAR in different groups(±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;LV:Left ventricular;AN:Area of necrosis;AAR:Area at risk*P＜0.05 vs Con group;#P＜0.05 vs MPostC;△P＜0.05 vs RPostC

Group AAR/LV AN/AAR Con 0.3819±0.0710 0.3346±0.0805 Sham× ×MPostC 0.2396±0.0405 0.1809±0.0416*RPostC 0.3666±0.0484 0.1711±0.0774*MPostC+RPostC 0.2655±0.0595 0.0688±0.0536*#△

3 討論

心肌缺血發(fā)生后,早期開通閉塞的冠狀動脈,有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注,是限制和縮小梗死面積、改善預(yù)后的關(guān)鍵。然而再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/RI)卻嚴重影響了血管開通的治療效果。I/RI是指缺血期處于可逆損傷的心肌細胞恢復(fù)血供后產(chǎn)生的較為嚴重的損傷。是一個涉及多個方面的復(fù)雜的病理生理過程。近年來,人們對減輕I/RI的方法進行了較多的研究,如有學者較多地研究了缺血預(yù)處理,并試圖把它應(yīng)用于臨床實踐中,但因臨床上心肌缺血事件的不可預(yù)見性使其臨床應(yīng)用受到很大限制。

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Tab.4 Data of CPK and LDH in different groups(U/L,±s,n=6)

Con:Control group;Sham:Sham operation group;MPostC:Myocardial postconditioning group;RPostC:Remote postconditioning group;MPostC+RPostC:Myocardial postconditioning plus remote postconditioning group;CPK:Creatine kinase;LDH:Lactate dehydrogenase*P＜0.05 vs con;#P＜0.05 vs MPostC+RPostC

Group Categorization Baseline 45 min after ischemia 60 min after reperfusion 120 min after reperfusion Con CPK 1803.83±499.42 2050.00±591.43 3832.67±894.02 6885.17±1201.82 LDH 165.10±85.17 185.15±100.18 274.15±102.06 324.42±89.01 Sham CPK 1810.33±450.53 1758.67±405.28 1880.17±561.98 1784.50±490.40 LDH 186.23±66.72 188.78±43.73 181.25±42.47 180.00±46.73 MPostC CPK 1907.67±639.90 2072.77±722.89 3249.13±756.12*# 4246.97±871.92*#LDH 63.65±28.52 96.45±33.73 135.47±40.12 249.63±144.23 RPostC CPK 1838.50±661.40 1981.83±724.67 3113.67±788.38*# 3997.33±864.77*#LDH 195.33±79.11 226.30±87.74 251.63±70.36 294.10±95.37 MPostC+RPostC CPK 1833.18±383.76 1982.28±365.48 2266.32±380.15 3122.15±655.56 LDH 79.49±35.56 111.38±50.83 143.55±38.13 221.91±87.99

而缺血后處理(ischemic postconditioning,IPO)作為一項可能行之有效的干預(yù)措施逐漸受到關(guān)注。后處理是指在冠狀動脈再灌注開始即刻進行短暫、重復(fù)的開通及再閉,隨后恢復(fù)冠脈血流的方法。到目前為止心肌缺血后處理心臟保護措施已經(jīng)在不同動物模型及離體[2]心臟上得到證實,而且已有實驗[3]證實缺血后處理產(chǎn)生的心臟保護作用確可達到與心肌缺血預(yù)處理相似的效果。且有學者發(fā)現(xiàn),不僅心肌缺血后處理可對缺血/再灌注心肌產(chǎn)生保護,且體內(nèi)遠端主要血管的缺血后處理即遠端缺血后處理也可對缺血/再灌注的心肌產(chǎn)生保護[4]。但心臟血管的缺血后處理以及遠端器官的缺血后處理對心肌的保護作用有否差異,以及二者聯(lián)合后能否疊加目前尚未見報道。

從本研究可以看出,心臟近端缺血后處理以及遠端器官缺血后處理均可對缺血/再灌注心肌產(chǎn)生保護作用,而且兩種方法同時實施,保護作用可以疊加;但兩種方法之間的心肌保護作用未見明顯差異。

有關(guān)近端后處理產(chǎn)生的機制研究較多,目前較為公認的是近端后處理產(chǎn)生保護作用是通過再灌注損傷補救酶通路(reperfusion injury salvage kinase,RISK)來完成其保護作用的,它可能影響線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP),一種在再灌注開始時開放能促進細胞死亡的非特異性孔的開放,進而減少心肌細胞的壞死[5]。其具體過程可以分為觸發(fā),調(diào)節(jié)及最終效應(yīng)三個步驟。

觸發(fā):在后處理過程中產(chǎn)生或延緩清除的一些物質(zhì)如腺苷和緩激肽(Bradykinin,BK)及阿片類物質(zhì)等作為配體可與細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合,導(dǎo)致后處理過程中的級聯(lián)效應(yīng),一氧化氮(NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS。需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇,包括 :O2-·、H2O2及 HO2·、·OH等)也可能參與觸發(fā)。

調(diào)節(jié):配體與細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后激活RISK通路,結(jié)果之一就是導(dǎo)致磷酸化的內(nèi)生性一氧化氮合酶(NOS)表達增多。這樣,在NOS激活之后,環(huán)化鳥苷酸(cyclic guangylic acid,cGMP)產(chǎn)生,AMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase,PKG)激活,然后 ROS產(chǎn)生。而 cGMP、PKG的激活,線粒體KATP的開放和ROS的產(chǎn)生可以被考慮為后處理的中間調(diào)解步驟,這些步驟有可能激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)。有研究證實在后處理再灌注過程中,cGMP產(chǎn)物增多,產(chǎn)生抑制MPTP開放的最終效應(yīng)[6]。

最終效應(yīng):再灌注損傷的一個基礎(chǔ)性步驟就是最終MPTP的開啟。MPTP開啟可以促進細胞的凋亡和壞死。而近端后處理可以明顯的降低MPTP的開啟,這樣就能夠有效的避免細胞的凋亡及壞死的發(fā)生。

同時后處理時有效減少細胞的鈣超載及所造成的低 pH值環(huán)境亦是抑制MPTP開放的重要的原因[7]。

而對于遠端后處理而言研究較少,有關(guān)遠端缺血后適應(yīng)的保護作用的確切機制目前尚不清楚。有研究[8]表明非選擇性的腺苷受體阻滯劑8-SPT可以抑制腎動脈缺血后適應(yīng)的保護作用。同時有研究表明[9]不同的KATP通道阻斷劑消除了后處理的保護效應(yīng)。以上實驗證明了腺苷、K+ATP通道可能同樣參與遠端后適應(yīng)的保護機制。但其確切機制尚需進一步研究。

這樣具體到本研究而言,產(chǎn)生以上結(jié)果可能有如下原因:(1)近端后處理通過RISK通路起到保護作用,而遠端后處理通過K+ATP通道途徑起到保護作用,兩者產(chǎn)生保護作用的途徑不同,故可產(chǎn)生疊加效應(yīng)。(2)近端后處理及遠端后處理都通過RISK通路起作用,但由于近端后處理與遠端后處理過程中涉及到的缺血肌肉類型不同(心肌與骨骼肌),所以產(chǎn)生的觸發(fā)保護作用的配體物質(zhì)不同,從而造成兩者的保護效應(yīng)的疊加。以上只是基于現(xiàn)有研究的推論,確切的機制尚需進一步的研究。

綜上所述,心肌的缺血后處理已經(jīng)成為當前的一個熱門研究方向,且目前對其機制并不甚明了,本研究通過其實驗結(jié)果,提示我們在臨床上對于ACS的患者可以采用近端后處理(如介入治療時球囊擴張-收縮)及遠端后處理(如用止血帶造成遠端肢體缺血-放開)相結(jié)合的方式來進行急性冠脈介入治療,這樣對于減少患者心肌再灌注損傷,提高患者生存率及生活質(zhì)量,具有十分重要的意義。

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