基于1H-NMR共振技術(shù)對(duì)涪麥冬與綿麥冬化學(xué)成分的比較研究

錢(qián)進(jìn)，肖草茂（1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌 330003；.江西省藥物研究所，南昌 33009）

麥冬為百合科植物，以塊根入藥，具有養(yǎng)陰清熱、潤(rùn)肺止咳的功效[1，2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，麥冬具有強(qiáng)心、利尿、抗菌的作用，臨床用于治療肺燥干咳、津傷口渴、心煩失眠等證。國(guó)內(nèi)、外研究表明，麥冬主要化學(xué)成分為甾體皂苷、高異黃酮類、多糖、氨基酸等[3，4]。迄今為止，從麥冬類植物及其變種中共分離鑒定出的甾體皂苷有近50種，高異黃酮有約30種[5]。

四川為麥冬的主產(chǎn)區(qū)之一，川產(chǎn)麥冬俗稱川麥冬，而涪麥冬與綿麥冬是川麥冬的2個(gè)主要品種。涪麥冬來(lái)源于麥冬Ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker-Gawler的干燥塊莖，主產(chǎn)于四川綿陽(yáng)，其根莖顆粒細(xì)小而產(chǎn)量少；綿麥冬為麥冬栽培變種 O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler Cv.Mianyangensis，其產(chǎn)量較大。由于涪麥冬與綿麥冬在產(chǎn)量上相差很大，其市場(chǎng)價(jià)格也有較大的差別，導(dǎo)致麥冬的使用比較混亂，經(jīng)常將綿麥冬當(dāng)涪麥冬使用。為了考察這2個(gè)品種的產(chǎn)品混用是否合理，筆者采用模式識(shí)別中的偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）方法，通過(guò)對(duì)二者核磁共振氫譜（1H-NMR）的比較研究，分析其化學(xué)成分差異，為川麥冬藥材及其制劑研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

BS 224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SENCOR-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海予華科技有限公司）；W201D恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）；AVⅡ-600核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）。

DMSO-d6（瑞士ARMAR CHEMICALS公司）；甲醇為分析純；Mestrenova軟件（上海精博軟件公司）；SIMCA-P 11.0軟件（北京天演融智軟件有限公司）。綿麥冬采自四川綿陽(yáng)三臺(tái)，涪麥冬采自四川彭州，均經(jīng)江西省藥物研究所朱良輝研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

稱取麥冬碎片樣品2 g，加入甲醇20mL，50℃水浴溫浸提取3次，每次1 h；合并濾液，減壓濃縮至無(wú)液體，再真空干燥30min。稱取0.05 g提取物，用0.05mL DMSO-d6溶解，制得供1H-NMR測(cè)定的樣品溶液。樣品溶液在恒溫296 K（1K＝－272.15℃）的環(huán)境中，以DMSO-d6為溶劑，掃描128次，采樣時(shí)間域?yàn)?4 k，采樣時(shí)間為2.66 s，脈沖間隔為3.00 s，采用標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)飽和脈沖序列壓制水峰信號(hào)，利用CPMG脈沖序列抑制大分子信號(hào)[6]。

2.2 結(jié)果

2.2.1 涪麥冬和綿麥冬的PLS-DA法分析 按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定出來(lái)的涪麥冬和綿麥冬F(xiàn)ID自由衰減信號(hào)，用Mestrnova軟件將其轉(zhuǎn)化成1H-NMR圖譜，對(duì)1H-NMR圖譜以0.04 ppm單位進(jìn)行分段、積分[5]，得到每個(gè)樣本的各化學(xué)位移值段與相對(duì)應(yīng)的峰面積積分值所組成的Excel表。將Excel表導(dǎo)入SIMCA-P 11.0軟件中，對(duì)涪麥冬和綿麥冬進(jìn)行PLS-DA法分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 主成分1對(duì)主成分2的得分散點(diǎn)圖Fig 1 The score scatter diagram of the principal component 1 for the principal component 2

由圖1可知，涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)成分上有顯著差異:涪麥冬主要分布在主成分1的正值區(qū)域，而綿麥冬主要分布在主成分1的負(fù)值區(qū)域，說(shuō)明涪麥冬和綿麥冬化學(xué)成分上的差異主要體現(xiàn)在主成分1上。為了進(jìn)一步弄清涪麥冬和綿麥冬的化學(xué)成分在主成分1上的差異，筆者還對(duì)其作了主成分1對(duì)主成分2的載荷散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖2。

圖2 主成分1與主成分2的載荷散點(diǎn)圖Fig 2 The loading scatter diagram of the principal component 1 for the principal component 2

載荷散點(diǎn)圖是通過(guò)載荷圖轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)還原在1H-NMR上的圖，它反映了化學(xué)位移值的變化情況。由圖2可知，對(duì)正區(qū)域的樣本（涪麥冬）聚類貢獻(xiàn)最大的主要變量在化學(xué)位移δ3.80～3.20、δ7.80～7.10、δ9.60～8.80區(qū)間內(nèi)。據(jù)文獻(xiàn)[7，8]可知，化學(xué)位移在δ3.80～3.20區(qū)間主要為多糖信號(hào)峰以及甾體皂苷糖鏈部分的信號(hào)峰；δ7.80～7.10、δ9.60～8.80區(qū)間主要為芳香環(huán)上羥基氫或酚羥基信號(hào)峰[9，10]，故初步推斷涪麥冬的主要化學(xué)成分是多糖、甾體皂苷和高異黃酮類化合物。影響負(fù)區(qū)域的樣本（綿麥冬）的主要變量在化學(xué)位移δ2.80～3.10、δ3.30～3.80、δ6.20～9.20區(qū)間內(nèi)。據(jù)文獻(xiàn)[11]可知，δ2.80～3.10區(qū)間主要為二氫高異黃酮的3、11位的脂肪氫特征信號(hào)峰；δ3.30～3.80區(qū)間主要為多糖信號(hào)峰；δ6.50～9.00區(qū)間主要為高異黃酮類化合物的信號(hào)峰，其中δ6.20～7.00區(qū)間主要為高異黃酮類化合物B-環(huán)上的芳香氫特征信號(hào)峰。故可初步推斷綿麥冬的主要化學(xué)成分為高異黃酮類、多糖類及少量甾體皂苷類化合物，其中高異黃酮類化合物中的二氫高異黃酮占很大比例。

由圖2可知，正區(qū)域樣本與負(fù)區(qū)域樣本的載荷點(diǎn)分布差異較大；負(fù)區(qū)域樣本（綿麥冬）在化學(xué)位移δ6.20～9.20區(qū)間的載荷點(diǎn)相比正區(qū)域樣本（涪麥冬）更多。根據(jù)上述分析，該區(qū)域內(nèi)的信號(hào)峰主要為高異黃酮類化合物上的芳香氫或酚羥基信號(hào)峰，故可推斷出涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)成分上的主要差異在高異黃酮類化合物上。

2.2.2 涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜分析 為了更加清楚地比較涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)成分上的差異，筆者對(duì)涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜進(jìn)行了分析。涪麥冬6個(gè)樣本的1H-NMR圖見(jiàn)圖3；綿麥冬6個(gè)樣本的的1H-NMR見(jiàn)圖4。

圖3 涪麥冬的1H-NMR圖Fig 3 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler

圖4 綿麥冬的1H-NMR圖Fig 4 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.） Ker-Gawler Cv.Mianyangensis

由圖3、圖4可知，涪麥冬和綿麥冬各自6個(gè)樣本的1H-NMR圖譜基本相同，因此本試驗(yàn)分別選擇涪麥冬和綿麥冬其中一個(gè)樣本的1H-NMR圖譜進(jìn)行比較分析（圖5），找出涪麥冬和綿麥冬化學(xué)成分上的差異。

圖5 涪麥冬與綿麥冬的1H-NMR圖譜比較Fig 5 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler Cv.Mianyangensis

由圖5可知，涪麥冬和綿麥冬1H-NMR的信號(hào)峰均主要集中在化學(xué)位移δ8.30～0.50區(qū)間內(nèi)，二者的1H-NMR從整體上看似相近，表明涪麥冬和綿麥冬的大部分化學(xué)成分基本相同。但仔細(xì)比較發(fā)現(xiàn)，涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR也不完全相同，差別主要體現(xiàn)在峰高和化學(xué)位移上。涪麥冬和綿麥冬峰高不相同，可能是由于二者化學(xué)成分含量的差異所致，也有可能是由于FID信號(hào)轉(zhuǎn)換成1H-NMR過(guò)程中圖譜調(diào)整誤差所致。

為了找出涪麥冬和綿麥冬峰高差異所造成的原因，筆者在涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜上選擇一個(gè)比較孤立的信號(hào)，通過(guò)積分比進(jìn)行分析。對(duì)涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜反復(fù)比較，最終選擇化學(xué)位移為δ4.89處的信號(hào)峰，經(jīng)計(jì)算可知，該峰積分值在涪麥冬1H-NMR中占總積分值的0.8%，而在綿麥冬1H-NMR中占總積分值的1.0%，提示涪麥冬和綿麥冬峰高不相同，主要是由于兩者化學(xué)成分含量的差異所致。

圖5還顯示出涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜有較多差異之處，主要體現(xiàn)在化學(xué)位移δ7.80～6.50、δ6.00～4.20、δ3.85～3.55、δ3.10～2.90等區(qū)域內(nèi)。為了更加直觀顯示出涪麥冬和綿麥冬1H-NMR圖譜上的差異，筆者分別對(duì)化學(xué)位移δ8.30～7.00、δ7.00～6.00、δ6.00～4.00、δ4.00～2.40和δ2.40～0.50區(qū)域進(jìn)行分段圖譜分析，結(jié)果分別見(jiàn)圖6～圖10。

圖6 涪麥冬和綿麥冬在δ8.30～7.00區(qū)域的譜圖Fig 6 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.） Ker-Gawler Cv.Mianyangensis ranged 8.30～7.00

圖7 涪麥冬和綿麥冬在δ7.00～6.00區(qū)域的圖譜Fig 7 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler Cv.Mianyangensi ranged 7.00～6.00

圖6顯示的是1H-NMR上化學(xué)位移δ8.30～7.00區(qū)域內(nèi)的圖譜，該區(qū)域內(nèi)主要為高異黃酮類化合物的芳香氫或酚羥基信號(hào)峰[9，10]。涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR大部分信號(hào)峰化學(xué)位移值相同，且峰形也基本相近，表明在該區(qū)域內(nèi)涪麥冬和綿麥冬大部分高異黃酮類化合物基本相似。

圖8 涪麥冬和綿麥冬在δ6.00～4.00區(qū)域的圖譜Fig 8 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler Cv.Mianyangensis ranged 6.00～4.00

圖9 涪麥冬和綿麥冬在δ4.00～2.40區(qū)域的圖譜Fig 9 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler Cv.Mianyangensis ranged 4.00～2.40

圖10 涪麥冬和綿麥冬在δ2.40～0.50區(qū)域的圖譜Fig 10 1H-NMR of O.japonicus（Thunb.）Ker-Gawler and O.japonicus（Thunb.） Ker-Gawler Cv.Mianyangensis ranged 2.40～0.50

但從圖6還可看出，涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)位移δ8.30～7.00區(qū)域內(nèi)的圖譜有明顯差異，主要體現(xiàn)為以下兩方面:一是涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR信號(hào)峰峰高不同，二者該區(qū)域內(nèi)所有信號(hào)峰積分值分別占全譜的0.23%、0.75%，表明綿麥冬中高異黃酮類化合物的含量比比涪麥冬中的含量比高。二是綿麥冬在化學(xué)位移為δ7.46處有個(gè)單峰，較涪麥冬相應(yīng)位置信號(hào)峰強(qiáng)，該信號(hào)峰為高異黃酮類化合物2位烯氫信號(hào)[12]；涪麥冬較綿麥冬在化學(xué)位移為δ7.83處多一個(gè)寬單峰，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該信號(hào)為一類高異黃酮類化合物2位烯氫信號(hào)，該類化合物的B-環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為3′，4′位置的次甲二氧基取代[9，13]。上述結(jié)果表明，二者在化學(xué)位移δ8.30～7.00區(qū)域內(nèi)的差異主要在于高異黃酮的含量以及某些高異黃酮類化合物的種類上，其中綿麥冬中高異黃酮的含量較涪麥冬高。

圖7顯示出在化學(xué)位移δ7.00～6.00區(qū)域內(nèi)，綿麥冬的信號(hào)峰較涪麥冬多，而且峰高較涪麥冬高；綿麥冬在該區(qū)域所有信號(hào)峰積分值占全譜總積分值的5.4%，而涪麥冬為2.3%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化學(xué)位移在δ7.00～6.00區(qū)域內(nèi)的信號(hào)峰主要為高異黃酮B-環(huán)上的芳香氫信號(hào)峰，如4′-OH取代芳香氫特征信號(hào)峰在化學(xué)位移約為δ6.98、6.68處[12]，3′、4′-OH取代芳香氫特征信號(hào)峰在化學(xué)位移約為δ6.65、6.42、6.57處[9]，而3′，4′次甲二氧基取代芳香氫特征信號(hào)峰在化學(xué)位移約為δ6.76、6.80、6.86處[8]。圖7表明，綿麥冬中高異黃酮類化合物種類較涪麥冬多，含量較涪麥冬高。

由圖8可知，在化學(xué)位移δ6.00～4.00區(qū)域內(nèi)信號(hào)峰不多，主要為烯氫、糖端基氫以及少量脂肪氫信號(hào)峰；涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)位移δ4.26～4.40、4.90、5.15等處信號(hào)峰基本相同。由文獻(xiàn)可知，化學(xué)位移為δ4.26～4.40區(qū)域?yàn)槎涓弋慄S酮2位脂肪特征氫信號(hào)峰[9，11]，這表明兩者均含有二氫高異黃酮；化學(xué)位移在δ4.90與δ5.15處的信號(hào)峰主要為糖端基氫信號(hào)峰[7]。

由圖8還可看出，綿麥冬在化學(xué)位移δ6.00～4.00區(qū)域內(nèi)的信號(hào)峰比涪麥冬多，尤其是在化學(xué)位移為δ5.98、5.72、5.29、4.20處的信號(hào)峰比涪麥冬強(qiáng)。由文獻(xiàn)可知，化學(xué)位移為δ5.98處的信號(hào)峰除了可能為阿拉伯糖的端基氫信號(hào)峰外，還可能為高異黃酮8位芳香氫信號(hào)峰或3′，4′次甲二氧基信號(hào)峰?；瘜W(xué)位移為δ4.20處的信號(hào)峰除了可能為多糖信號(hào)峰外，還可能為某些二氫高異黃酮化合物2位脂肪特征氫信號(hào)峰[11]。上述結(jié)果表明，在化學(xué)位移δ6.00～4.00區(qū)域涪麥冬和綿麥冬均有二氫高異黃酮成分，該類成分在綿麥冬中有可能比涪麥冬更多。

由圖9可知，在化學(xué)位移δ4.00～2.40區(qū)域內(nèi)主要為多糖、甾體皂苷糖鏈以及二氫高異黃酮的特征脂肪氫信號(hào)峰[7，11]。涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)位移δ3.85～3.20區(qū)域的信號(hào)峰基本相似，該區(qū)域主要為多糖信號(hào)峰，其中化學(xué)位移δ3.80～3.70區(qū)域多個(gè)單峰為高異黃酮類化合物B-環(huán)上的甲氧基信號(hào)峰。綿麥冬在這一區(qū)域內(nèi)所有信號(hào)峰積分值比涪麥冬低，表明綿麥冬化學(xué)成分中多糖含量比涪麥冬低。

由圖9還可看出，綿麥冬在化學(xué)位移δ2.98～3.08區(qū)域存在一個(gè)多重峰，該信號(hào)較涪麥冬相應(yīng)位置的信號(hào)低。由文獻(xiàn)[11]可知，該區(qū)域主要為二氫高異黃酮3、11位的特征信號(hào)峰，表明涪麥冬和綿麥冬均含有二氫高異黃酮，并進(jìn)一步表明綿麥冬中的二氫高異黃酮成分比涪麥冬多。

圖10顯示的是涪麥冬和綿麥冬在化學(xué)位移δ2.40～0.50區(qū)域的圖譜，該區(qū)域主要為甾體皂苷信號(hào)峰。由圖10可知，二者在該區(qū)域內(nèi)信號(hào)峰較少、信號(hào)較弱，積分值分別為2.2%、2.7%?？赏茰y(cè)出涪麥冬和綿麥冬中甾體皂苷含量均相對(duì)高異黃酮低。

3 討論

涪麥冬和綿麥冬為川麥冬的2個(gè)主要品種，其1H-NMR圖譜大部分相似，表明二者大多數(shù)化學(xué)成分相近。綿麥冬為麥冬的栽培變種，故其化學(xué)成分與涪麥冬會(huì)有一定差異，這點(diǎn)可以從PLS-DA散點(diǎn)圖（圖1）上得到認(rèn)證。

PLS-DA法是通過(guò)采用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法來(lái)尋找樣本間的差異，而1H-NMR分析法則比較直觀地找出樣本間的差異，2種分析方法可以相互佐證。從PLS-DA載荷圖（圖2）分析可知，涪麥冬和綿麥冬化學(xué)成分上的主要差異在高異黃酮類化合物上，其中綿麥冬的高異黃酮類化合物比涪麥冬多。圖6、圖7顯示出涪麥冬和綿麥冬的1H-NMR圖譜有多處差異，這也表明綿麥冬的高異黃酮類化合物種類比涪麥冬多，含量比涪麥冬高。圖8則表明綿麥冬中的二氫高異黃酮比涪麥冬更多。PLS-DA法和1H-NMR分析得出的結(jié)論基本一致:綿麥冬比涪麥冬在高異黃酮類化合物上，尤其是在二氫高異黃酮上，種類更多，含量更高?？梢?jiàn)，綿麥冬不宜代替涪麥冬使用，二者也不宜混用。

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