玻璃體內(nèi)注射Infliximab對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用

劉 瑩 李 林 高曉唯 張振華 楊永利 趙旭東

葡萄膜炎是常見的眼部致盲性疾病，種類繁多，病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為多與自身免疫性疾病有關(guān)［1-2］。目前對葡萄膜炎還沒有明確或者有效的治療方案。傳統(tǒng)藥物一般首選糖皮質(zhì)激素［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Infliximab與可溶性和膜結(jié)合型TNF-α結(jié)合后可抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)活性，減輕炎性損害，現(xiàn)多用于治療前葡萄膜炎和后葡萄膜炎。本實驗通過利用牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為異體抗原，制備新西蘭大白兔BSA誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)模型，探討玻璃體內(nèi)注射Infliximab對EAU的治療作用。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年雌性新西蘭大白兔32只，體質(zhì)量1.0～1.5 kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只兔隨機(jī)分為3組:模型對照組和正常對照組各8只，治療組16只。正常對照組不造模，模型對照組和治療組兔雙眼均造模。

1.2 動物模型的建立 參照文獻(xiàn)［4］的方法:用電子天平精確稱量4～8℃保存的BSA粉劑4 g，用100 mL無菌注射用水充分溶解，配制為40 g·L－1BSA溶液。4 g·L－1鹽酸奧布卡因眼液表面麻醉后，玻璃體內(nèi)注射40 g·L－1BSA溶液0.25 mL(注射后以無菌棉簽按壓注射孔5 min，防止藥液外溢)。1周后，再用同樣的方法配制20 g·L－1BSA溶液，兔耳緣靜脈注入2.50 mL。1周后觀察兔眼情況，出現(xiàn)虹膜血管擴(kuò)張、充血，纖維素滲出，瞳孔膜閉等炎癥表現(xiàn)，為造模成功。

1.3 藥物注射方法 在造模成功后次日，各組分別行玻璃體內(nèi)注射1次，正常對照組和模型對照組注射生理鹽水0.1 mL，治療組注射10 g·L－1Infliximab(西安楊森制藥有限公司)0.1 mL。

1.4 兔活體眼部檢查 分別于造模前及造模后5 d、10 d、15 d裂隙燈顯微鏡和直接檢眼鏡下觀察兔眼部表現(xiàn)，并記錄房水閃輝情況。房水閃輝分級標(biāo)準(zhǔn)［5］:無房水閃輝;房水閃輝(+):微弱的房水閃輝;房水閃輝(++):中度的房水閃輝，可以辨別虹膜紋理;房水閃輝(+++):顯著的房水閃輝，虹膜紋理和晶狀體模糊;房水閃輝(++++):嚴(yán)重的房水閃輝，房水呈凝固狀態(tài)，伴大量纖維素性滲出物。

1.5 ELISA檢測和組織病理學(xué)觀察 造模前及造模后5 d、10 d、15 d隨機(jī)處死模型對照組和正常對照組兔各2只，治療組4只。前房穿刺，抽取房水0.1～0.2 mL，放入凍存管內(nèi)，于－80℃冰箱中保存。待標(biāo)本全部收集完后，按照ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司)說明書進(jìn)行操作，檢測房水中TNF-α和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的含量。在上述4個時間點抽取房水后，摘除兔雙側(cè)眼球，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定，24 h后石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，行組織病理學(xué)觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。ELISA測定結(jié)果用±s表示，差異用方差分析進(jìn)行檢驗;裂隙燈下房水閃輝的觀察用秩和檢驗，將房水閃輝的5個等級數(shù)量化，數(shù)值用平均秩號，比較各組平均秩號的大小。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔活體眼部表現(xiàn) 正常對照組前房清亮，虹膜紋理清晰可見，瞳孔圓，紅光反射存在，在任何階段均未出現(xiàn)過房水閃輝。模型對照組和治療組在造模前均無房水閃輝。按照無房水閃輝、房水閃輝(+)、房水閃輝(++)、房水閃輝(+++)、房水閃輝(++++)分級順序，在造模后5 d，模型對照組兔眼的數(shù)目分別為 0、0、1、2、9，治療組分別為 0、0、4、8、12，兩組通過秩和檢驗比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=－1.37，P＞0.05)。造模后10 d，模型對照組兔紅光反射消退，虹膜血管明顯擴(kuò)張、充血，瞳孔膜閉，瞳孔區(qū)可見大量的纖維素樣滲出(圖1A)。治療組兔虹膜血管中度擴(kuò)張、充血，瞳孔大小正常，前房內(nèi)僅見少量纖維素樣滲出，紅光反射輕度模糊(圖1B)。根據(jù)上述房水閃輝分級順序，造模后10 d，模型對照組數(shù)目分別為 0、1、1、1、5，治療組為 0、8、5、2、1;兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z= －2.69，P=0.00)，且模型對照組的平均秩號(17.75)大于治療組(9.88)。造模后15 d，模型對照組數(shù)目分別為0、0、1、1、2，治療組為 3、3、1、1、0，兩組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(Z= －2.43，P=0.01)。

2.2 ELISA法檢測房水TNF-α和IL-2的含量

正常對照組、模型對照組和治療組4個時間點房水中TNF-α和IL-2含量變化見表1-2。由表知，3組造模前房水中TNF-α和IL-2含量無差異。造模后5 d，模型對照組和治療組房水中TNF-α和IL-2含量均高于正常對照組(均為P＜0.05)，而模型對照組和治療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05);造模后10 d，模型對照組房水中TNF-α和IL-2含量繼續(xù)增加，而治療組含量均明顯下降(均為P＜0.05);造模后15 d，模型對照組房水中TNF-α和IL-2含量輕度下降，治療組繼續(xù)下降。造模后10 d、15 d，治療組TNF-α和IL-2含量均明顯低于模型對照組(均為 P=0.00)。

Figure 1 At 10 days after modeling，examination of rabbit eyes.A:In model control group，the iris blood vessels expanded obviously and a large amount of cellulose could be seen obviously in the pupil.B:In treatment group，the iris blood vessels expanded moderately and only a little cellulose could be seen in the anterior chamber 造模后10 d兔活體眼部檢查。A:模型對照組兔虹膜血管明顯擴(kuò)張、充血，瞳孔區(qū)可見大量纖維素樣滲出;B:治療組兔虹膜血管中度擴(kuò)張、充血，瞳孔大小正常，前房內(nèi)僅見少量纖維素樣滲出

表1 正常對照組、模型對照組和治療組4個時間點房水TNF-α含量比較Table1 Contents of TNF-α in aqueous humor among normal control group，model control group and treatment group at the four time points (ρ/ng·L－1)

表2 正常對照組、模型對照組和治療組4個時間點房水IL-2含量比較Table2 Contents of TNF-α in aqueous humor among normal control group，model control group and treatment group at the four time points (ρ/ng·L－1)

2.3 組織病理學(xué)觀察 正常對照組、模型對照組和治療組造模前雙眼均沒有任何病理改變。在造模后5 d、10 d、15 d光學(xué)顯微鏡下觀察3組的組織病理學(xué)切片顯示有差異，這種差異在造模后10 d最明顯:模型對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，層次不清晰，可以觀察到炎細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)破壞(圖2A);而治療組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)基本完整，層次基本清晰，炎細(xì)胞浸潤較少(圖2B)。正常對照組始終未見任何病理改變。

3 討論

葡萄膜炎是威脅視力的嚴(yán)重疾病，目前用于研究葡萄膜炎的動物模型通常有兩種:內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎和EAU。前者通常用來研究人類全葡萄膜炎或急性前葡萄膜炎，而EAU常用來研究人類全葡萄膜炎或后葡萄膜炎［6-7］。本實驗用BSA作為異體抗原，玻璃體內(nèi)、耳緣靜脈兩次注射法免疫新西蘭大白兔，成功建立EAU模型，為研究Infliximab對葡萄膜炎的治療提供了重要的工具。

目前用于治療葡萄膜炎的首選藥物為糖皮質(zhì)激素，常用藥物有曲安奈德和地塞米松。糖皮質(zhì)激素具有抗炎和免疫抑制的療效，能選擇性地作用于免疫活性細(xì)胞亞群或是某一環(huán)節(jié)，暫時阻止疾病的發(fā)生發(fā)展，減輕水腫、滲出并抑制炎性介質(zhì)的釋放［8-9］。但是長期應(yīng)用常常會導(dǎo)致全身副作用，如向心性肥胖，血壓、血糖升高，加重消化性潰瘍，誘發(fā)或加重感染，精神失常，傷口愈合延遲，骨質(zhì)疏松等［9-10］;眼部毒副作用如眼壓升高、晶狀體后囊膜混濁、角膜上皮毒性等［10］。

研究發(fā)現(xiàn)葡萄膜炎是由輔助性T(Th)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?1-12］，而 TNF-α 由 Th細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌。TNF-α是Th1反應(yīng)的主要炎癥介質(zhì)，而TNF-α拮抗劑可以抑制Th細(xì)胞，從而進(jìn)一步抑制浸潤性巨噬細(xì)胞活化，保護(hù)葡萄膜炎中的組織不受破壞。

Figure 2 The histopathological examination at 10 days after operation(HE，×100).A:The structure of each retinal layer in model control group was unclear，arranged disorderly and the inflammatory response was clear.B:The structure of each retinal layer in treatment group was clear and the inflammatory response was relieved obviously 造模后10 d兔眼球組織病理學(xué)切片像(HE，×100)。A:模型對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，層次不清晰，炎癥明顯;B:治療組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)基本完整，層次基本清晰，炎癥明顯減輕

生物制劑Infliximab是TNF-α人鼠嵌合單克隆抗體的拮抗劑，它與可溶性和膜結(jié)合型TNF-α結(jié)合后抑制TNF-α活性，減輕炎性損害。Infliximab在風(fēng)濕病、克羅恩病等方面應(yīng)用比較多，在這些方面主要的給藥途徑是全身靜脈用藥，但全身用藥的不良反應(yīng)較多，例如可加重心臟損害，導(dǎo)致多發(fā)性硬化，增強(qiáng)傳染病的活動性等。研究表明，在眼科領(lǐng)域只有玻璃體內(nèi)注射會減少全身并發(fā)癥的發(fā)生幾率，同時增加視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的有效藥物濃度［13-14］，所以本實驗我們采用玻璃體內(nèi)注射Infliximab應(yīng)用于兔葡萄膜炎的治療研究中，對比觀察正常對照組、模型對照組和治療組兔的眼部表現(xiàn)和組織病理學(xué)改變。結(jié)果顯示，治療后治療組房水閃輝數(shù)目少于模型對照組，同時組織病理學(xué)表現(xiàn)明顯減輕，這充分說明治療組對炎癥起到了很好的控制作用。通過ELISA法檢測兔房水中TNF-α和IL-2的含量，治療后治療組含量均明顯低于模型對照組，充分說明了Infliximab能明顯降低房水中TNF-α和IL-2的水平，從而減輕了眼部組織的損害，改善了葡萄膜炎的病情。Infliximab為葡萄膜炎的治療開辟了新的思路和方法。

當(dāng)然本實驗存在一些不足之處，如樣本量有限致房水的采集數(shù)量有限，這樣就無法檢測房水細(xì)胞中的多個因子，限制了對其他相關(guān)細(xì)胞因子的研究。現(xiàn)在有一種新的技術(shù)，即BD公司的液相多重蛋白定量技術(shù)(BD CBA)，可以同時檢測多種細(xì)胞因子，但是需要用流式細(xì)胞儀，價格也較貴。Infliximab對葡萄膜炎的治療多為小樣本臨床觀察，玻璃體內(nèi)注射的劑量、次數(shù)、間隔時間及它的安全性和長期效果有待于進(jìn)一步實驗研究。Infliximab的毒副作用及價格昂貴也對該藥的臨床應(yīng)用起到了限制。

1 楊培增.葡萄膜炎的研究進(jìn)展［J］.中華眼科雜志，2005，41(12):1149-1152.

2 楊培增.葡萄膜炎治療的最新進(jìn)展［J］.中國實用眼科雜志，2002，20(2):83-87.

3 Demir T，Godekmerdan A，Balba M，Turkcuoglu P，Ilhan F，Demir N.The effect of infliximab，cyclosporine A and recombinant IL-10 on vitreous cytokine levels in experimental autoimmune uveitis［J］.Indian J Ophthalmol，2006，54(4):241-245.

4 吳樹楊，肖繼皋，王育良.牛血清白蛋白誘發(fā)兔葡萄膜炎的免疫病理形態(tài)學(xué)觀察［J］.中華眼科雜志，1994，10(3):153-155.

5 楊培增，李紹珍.葡萄膜炎［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:172-173.

6 Caspi RR，Silver PB，Luger D，Cortes LM，Pennesi G，Mattapallil MG，et al.Mouse models of experimental autoimmune uveitis［J］.Ophthalmic Res，2008，40(3-4):169-174.

7 Rosenbaum JT，Rosenzweig HL，Smith JR，Martin TM，Planck SR.Uveitis secondary to bacterial products［J］.Ophthalmic Res，2008，40(3-4):165-168.

8 Gaudio PA.A review of evidence guiding the use of corticosteroids in the treatment of intraocular inflammation［J］.Ocul Immunol Inflamm，2004，12(3):169-192.

9 Lyon F，Gale RP，Lightman S.Recent developments in the treatment of uveitis:an update［J］.Expert Opin Investig Drugs，2009，18(5):609-616.

10 Cunningham ET Jr，Wender JD.Practical approach to the use of corticosteroids in patients with uveitis［J］.Can J Ophthalmol，2010，45(4):352-358.

11 Crane IJ，F(xiàn)orrester JV.Th1 and Th2 lymphocytes in autoimmune disease［J］.Crit Rev Immunol，2005，25(2):75-102.

12 Luger D，Caspi RR.New perspectives on effector mechanisms in uveitis［J］.Semin Immunopathol，2008，30(2):135-143.

13 Lin J，Ziring D，Desai S，Kim S，Wong M，Korin Y，et al.TNF alpha blockade in human disease:an overview of efficacy and safety［J］.Clin Immunol，2008，126(1):13-30.

14 Giansanti F，Ramazzotti M，Vannozzi L，Rapizzi E，F(xiàn)iore T，Iaccheri B，et al.A pilot study on ocular safety of intravitreal infliximab in a rabbit model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49(3):1151-1156.