高/低侵襲轉(zhuǎn)移性肺癌干細(xì)胞模型的建立

曾 芳 劉曉光 樂涵波

近20年來，中國肺癌導(dǎo)致的死亡超過癌癥總死因的20%，其發(fā)生率和病死率在我國男性居惡性腫瘤之首位，在女性僅次于乳腺癌居第2位［1］。雖然近年來肺癌的診治水平有了明顯進(jìn)步，形成了以手術(shù)切除為主，化療、放療、各種介入治療、免疫和中醫(yī)藥治療為輔的綜合治療模式，但肺癌具有起病隱匿、潛伏期長、惡性高、進(jìn)展快、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差、病死率高等特點(diǎn)，導(dǎo)致全球肺癌患者術(shù)后5年生存率僅15%［2］。其原因可能是肺癌干細(xì)胞(lung cancer stem cells，LTSCs)的存在。LTSCs成瘤能力極強(qiáng)，分化程度極低，是肺癌組織發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)和源頭［3］。有學(xué)者提出LTSCs既是肺癌轉(zhuǎn)移的“種子”，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要承擔(dān)者［4］。因此，人們推斷肺癌是肺癌干細(xì)胞增殖和分化形成的腫瘤器官，肺癌干細(xì)胞的殘存是肺癌復(fù)發(fā)的根源［5，6］。

目前開展LTSCs研究的首要問題就是分離鑒定。普遍的方法是采用Hoechst 33342染色干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選肺癌細(xì)胞系側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞的SP細(xì)胞分選技術(shù)，或者利用LTSCs特異性細(xì)胞表面分子標(biāo)志CD133+/CD90+/EpCAM+等經(jīng)磁珠或流式細(xì)胞儀分選LTSCs。然而這兩種分選方法均存在自身局限性。SP法主要因?yàn)镠oechst染料的毒性，可能造成主群細(xì)胞自我更新能力及致瘤性低的假象。其次，分選后的SP細(xì)胞不能完全體現(xiàn)LTSCs的特性和活性，甚至不能在體外繼續(xù)生長或體內(nèi)成瘤。而采用細(xì)胞表面標(biāo)志分離出來的LTSCs均一性不好，還可以細(xì)分成不同亞群，有些亞群的細(xì)胞根本不能成瘤，表明采用該方法篩選出來的不完全是LTSCs，或者是LTSCs存在著干性差別［7］。基于此，課題組設(shè)想建立一種高/低侵襲性肺癌干細(xì)胞(high/low invasion lung tumor stem cells，H/L-ILTSCs)模型，可以與目前的分選方法互為完善和補(bǔ)充，建立一種更加可靠的LTSCs。這對(duì)于LTSCs的機(jī)制研究及病理治療均有重要的意義，為研究肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的思路。

材料與方法

1材料:(1)主要試劑:人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446購上海中科院典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基購自Gibco公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自天津潤泰科技發(fā)展有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Hy-Clone公司。Transwell小室購自coring公司。Matrigel膠購自BD公司。胰蛋白酶、MTT購自碧云天生物科技有限公司。NOD-SCID免疫缺陷裸鼠購自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CD133、CD44磁珠及流式抗體分別購自Miltenyi及BD公司。(2)細(xì)胞培養(yǎng):將NCI-H446細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含10%胎牛血清、青霉素100U/ml和鏈霉素100mg/L，置37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)備用。

2.方法:(1)高/低遷移性的NCI-H446細(xì)胞的分離:取對(duì)數(shù)生長期NCI-H446細(xì)胞及未涂Matrigel膠的transwell小室，參照Tie等［8］文獻(xiàn)操作。直接將NCI-H446細(xì)胞懸液加到上室，常規(guī)培養(yǎng)24h后，分別取出侵襲小室上、下室細(xì)胞。將穿過膜(下室)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后再次通過未涂Matrigel膠的transwell小室，獲取遷移能力高的下室細(xì)胞;將未穿過膜(上室)的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后再次通過未涂Matrigel膠的transwell小室，獲取遷移能力低的上室細(xì)胞。如此反復(fù)10次后，分離得到高/低遷移能力的NCI-H446細(xì)胞。(2)高/低侵襲轉(zhuǎn)移性的NCI-H446細(xì)胞的分離:取上述分離得到的對(duì)數(shù)生長期高/低遷移能力的NCI-H446細(xì)胞及涂有Matrigel膠的transwell小室。直接將高遷移能力的NCI-H446細(xì)胞懸液加到上室，常規(guī)培養(yǎng)24h后，取出侵襲小室下室細(xì)胞，獲得高侵襲轉(zhuǎn)移能力的NCI-H446細(xì)胞;將低遷移能力的NCI-H446細(xì)胞懸液加到上室，常規(guī)培養(yǎng)24h后，取出侵襲小室上室細(xì)胞，獲得低侵襲轉(zhuǎn)移能力的NCI-H446細(xì)胞。(3)H/LILTSCs、H/L-ILTSCs的分離:CD133、CD44為肺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志采用磁珠分選法。高侵襲轉(zhuǎn)移性NCI-H446肺癌細(xì)胞篩選CD133+/CD44+細(xì)胞為高侵襲轉(zhuǎn)移能力NCI-H446肺癌干細(xì)胞;低侵襲轉(zhuǎn)移能力NCI-H446肺癌細(xì)胞篩選CD133+/CD44+細(xì)胞為低侵襲轉(zhuǎn)移能力NCI-H446肺癌干細(xì)胞。參照Miltenyi公司試劑盒說明書，將高/低侵襲性NCIH446肺癌細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入CD133、CD44等磁珠混勻，冰上放置30min后，加CD133/2(293C3)-PE、CD44-FITC染色孵育5min，進(jìn)行磁珠分選后流式細(xì)胞儀上檢測(cè)純度。(4)H/LILTSCs的鑒定及侵襲轉(zhuǎn)移特性分析:①M(fèi)TT比色法檢測(cè)HILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞的生長增殖能力:收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，每孔加入200μl，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度103～104/孔。5%CO2，37℃ 孵育，過夜后在 3、6、12、18、24、30、36、42、48h等不同時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔加20μlMTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。加入150μl二甲基亞砜，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490nm處測(cè)量各孔的吸光值。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度(A)值，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線;②Transwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)分析H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力:取分離得到的高/低侵襲轉(zhuǎn)移能力的NCI-H446細(xì)胞及NCI-H446細(xì)胞，在侵襲小室上室加對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞1×104個(gè)/毫升，用含0.5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。下室加入含10%胎牛血清DMEM/F 12培養(yǎng)基。每組細(xì)胞重復(fù)3個(gè)樣本，常規(guī)培養(yǎng)48h后取出小室，擦去微孔膜上層細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察膜下層細(xì)胞并計(jì)數(shù)。采用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)5個(gè)視野下的平均穿膜數(shù)(%);③采用免疫缺陷動(dòng)物成瘤能力對(duì)H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞進(jìn)行鑒定:取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞及4～8周NOD-SCID免疫缺陷小鼠，按1∶1比例與Matrigel混合。皮下注射100μl。每周1次觀察腫瘤生長狀況，至腫瘤直徑≥1cm或者觀察期達(dá)4周時(shí)將小鼠斷頸處死，觀察各組小鼠有無腫瘤形成，摘取皮下腫瘤檢查瘤體生長形態(tài)、直徑、質(zhì)地、活動(dòng)度。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。兩組資料均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞的磁珠分選的純度:H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCI-H446細(xì)胞CDl33+/CD44+細(xì)胞的比例分別為(94.85±2.62)%、(94.03±1.53)%、(9.48±2.14)%。其中H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞 CDl33+/CD44+比例均高于培養(yǎng)的NCI-H446細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而 H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞 CDl33+/CD44+比例沒有差別(P＞0.05)。故 H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞的磁珠分選的純度較高，達(dá)到了90%以上，見圖1。

2.采用MTT法檢測(cè)H-ILTSCs、L-ILTSCs的生長增殖能力:連續(xù)培養(yǎng)2天的吸光度值繪制生長曲線。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長 HILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞的吸光度值是逐漸增高的。在相同的時(shí)間內(nèi)，H-ILTSCs的吸光度值較L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞明顯增高，顯示更強(qiáng)的體外增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而L-ILTSCs、NCI-H446細(xì)胞增殖速度相當(dāng)，無明顯差異(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs的細(xì)胞增殖能力很強(qiáng)，遠(yuǎn)高于L-ILTSCs和NCI-H446細(xì)胞，見圖2。

3.采用transwell腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)鑒定H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力:取相同H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)及NCI-H446細(xì)胞密度通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCIH446細(xì)胞鏡下5個(gè)視野細(xì)胞平均穿膜數(shù)分別是402±40、42 ±3、59±4。H-ILTSCs的穿膜數(shù)是NCI-H446細(xì)胞的近7倍，是L-ILTSCs的近10倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而L-ILTSCs與NCI-H446細(xì)胞的平均穿膜數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)，遠(yuǎn)高于L-ILTSCs和NCI-H446細(xì)胞，見圖3。

圖2 H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCI-H446細(xì)胞的生長增殖曲線

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力(×400)

4.H-ILTSCs、L-ILTSCs細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物成瘤能力鑒定:接種 H-ILTSCs、L-ILTSCs及 NCIH446細(xì)胞裸鼠在6周后可觀察到形成明顯的移植瘤，成瘤率100%。同樣以5×105細(xì)胞數(shù)量接種的情況下，H-ILTSCs形成的移植瘤體積為2380.6±685.86mm，L-ILTSCs形成的移植瘤體積為2380.60±685.86mm，而NCI-H446細(xì)胞形成的移植瘤體積為354.40±67.62mm。因此，H-ILTSCs細(xì)胞形成的移植瘤體積大于L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞的移植瘤體積(P＜0.01)，L-ILTSCs注射裸鼠形成的移植瘤體積與NCI-H446細(xì)胞無明顯差別(P＞0.05)。因此，H-ILTSCs相比L-ILTSCs細(xì)胞具有更強(qiáng)的干性特征，其裸鼠成瘤能力遠(yuǎn)高于L-ILTSCs及NCIH446細(xì)胞，見圖4。

討 論

LTSCs是肺癌研究領(lǐng)域的最新前沿，LTSCs的研究不但有助于了解肺癌的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時(shí)可能對(duì)肺癌的臨床診斷及治療帶來重大突破。它為腫瘤研究開辟了一個(gè)新的視野，這將徹底地顛覆腫瘤的既往治療策略。然而，LTSCs從標(biāo)志物篩選、細(xì)胞分選到培養(yǎng)技術(shù)，從基本生物學(xué)特性、啟動(dòng)腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制到檢測(cè)和治療意義，都還存在諸多科學(xué)問題亟待解決。

圖4 H-ILTSCs、L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物成瘤能力比較(移植5×105細(xì)胞，6周)

我們知道，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移啟動(dòng)中的一個(gè)關(guān)鍵過程是上皮細(xì)胞—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT以上皮細(xì)胞極性喪失并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和運(yùn)動(dòng)能力為特征，可調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，并可能誘導(dǎo)TSCs的形成。一些學(xué)者認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移不再是惡性腫瘤進(jìn)展過程中的晚期事件，原位癌或未惡變的上皮細(xì)胞即有轉(zhuǎn)移的能力［9］。Peter［10］證實(shí)成熟的上皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)化了的癌細(xì)胞經(jīng)過EMT能夠獲得干細(xì)胞特性。Hermann等［11］進(jìn)一步判斷EMT過程中關(guān)鍵細(xì)胞可能是TSCs，完成這種轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞實(shí)際上是轉(zhuǎn)移性 TSCs或侵襲性 TSCs。Mani［12］也認(rèn)為EMT可能使乳腺癌細(xì)胞同時(shí)具有轉(zhuǎn)移和干細(xì)胞特性的通路，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移位置成長為肉眼可見的腫瘤。George等［13］采用原代培養(yǎng)及永生化的前列腺癌細(xì)胞系，經(jīng)流式細(xì)胞儀通過CD44+等表面標(biāo)志篩選前列腺癌細(xì)胞亞群，通過Matrigel腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)和NOD/SCID免疫小鼠體內(nèi)成瘤能力證實(shí)CD44+前列腺癌細(xì)胞具有侵襲性，基因芯片分析侵襲性前列腺癌細(xì)胞具有干細(xì)胞基因組特征，屬于前列腺TSCs。Hermann等［14］利用人胰腺癌細(xì)胞作為模型，用原代和永生化細(xì)胞系識(shí)別出了一小群類似于干細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞，其表達(dá)CD133和趨化因子受體4(chemokinereceptor 4，CXCR4)，當(dāng)研究人員將這些細(xì)胞注射入小鼠中時(shí)，小鼠形成腫瘤并很快發(fā)生轉(zhuǎn)移，說明CD133+和CXCR4+癌干細(xì)胞是腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的。陳宏昌等［15］發(fā)現(xiàn) CK7-/CK20+/CEA+/SCCA-表達(dá)的UP-LN1癌細(xì)胞為TSCs，同時(shí)大量陽性表達(dá)CD133、ABCC1、ABCC4、ABCG2 等常見 TSCs標(biāo)志，其表達(dá)CD133+和CXCR4+的TSCs具有侵襲和轉(zhuǎn)移潛能，TSCs可被CXCR4誘導(dǎo)成為轉(zhuǎn)移性TSCs。

因此，本課題組基于TSCs前期研究成果，首次提出“H/L-ILTSCs”的概念，認(rèn)為這可能是肺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)及源頭。以H/L-ILTSCs為重點(diǎn)研究對(duì)象，揭示肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的源頭，在研究思路和研究內(nèi)容上具有創(chuàng)新性。那么，如何建立H/LILTSCs細(xì)胞模型呢?腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移啟動(dòng)中的一個(gè)關(guān)鍵過程是上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，EMT 是以上皮細(xì)胞極性喪失并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型和運(yùn)動(dòng)能力為特征，可調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)TSCs的形成。Milena認(rèn)為在腫瘤發(fā)展過程中，發(fā)生EMT改變的腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移、成瘤能力均大為增強(qiáng)，并獲得了干細(xì)胞特性。由上可知，分化成熟的上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞能夠通過EMT獲得干細(xì)胞特性，反之，TSCs能否發(fā)生EMT而獲得強(qiáng)大的運(yùn)動(dòng)能力從而決定腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這種疑問成為我們課題思路及技術(shù)實(shí)施的關(guān)鍵點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，CD133、CD44代表原始的、未分化的標(biāo)志，可作為分選 LTSCs的侯選標(biāo)志。選擇 CD133、CD44細(xì)胞表面蛋白磁珠分選來識(shí)別和分離LTSCs。通過流式分析純度發(fā)現(xiàn)NCI-H446細(xì)胞中CD133+/CD44+的細(xì)胞比例為(9.48±2.14)%，遠(yuǎn)低于分選出來的CD133+/CD44+細(xì)胞比例為90%以上的H/L-ILTSCs。在transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)高度表達(dá)CD133+/CD44+的H-ILTSCs侵襲能力明顯高于L-ILTSCs及原肺癌細(xì)胞NCI-H446。

本實(shí)驗(yàn)闡明H-ILTSCs的生長增殖，侵襲轉(zhuǎn)移及成瘤能力均高于L-ILTSCs及NCI-H446細(xì)胞。而L-ILTSCs的生長增殖，侵襲轉(zhuǎn)移及成瘤能力與NCI-H446沒有顯著差別。提示NCI-H446細(xì)胞中可以分離和富集H/L-ILTSCs。課題組建立了一種更為可靠的H/L-ILTSCs模型，且二者存在著干性差別。

腫瘤的惡性程度與其細(xì)胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)，惡性程度越高的腫瘤細(xì)胞體外生長增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng);反之，惡性程度低的腫瘤細(xì)胞的體外生長增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力越弱。因此，在未來的腫瘤防治研究或藥物篩選中，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)針對(duì)H-ILTSCs的治療作用，力求將H-ILTSCs全部清除。此外，H/L-ILTSCs的提出為下一步研究肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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