化學(xué)發(fā)光法和放射免疫法檢測胰島素

魯 彥 岳建云 苑 芳 黃 瑋 王成龍 杜 薇

酶聯(lián)免疫吸附試驗(EIA)、放射免疫(RIA)和化學(xué)發(fā)光(CLIA)技術(shù)是當(dāng)代蛋白質(zhì)和多肽定量3種重要的檢測技術(shù)。化學(xué)發(fā)光技術(shù)產(chǎn)生于1977年，是由Halman在放射免疫技術(shù)的原理基礎(chǔ)之上，將化學(xué)發(fā)光和免疫反應(yīng)結(jié)合建立起來的方法［1］。ADVIA Centaur發(fā)光儀(以下簡稱CP)是西門子公司收購前德林公司后開發(fā)出來的產(chǎn)品。筆者所在科室2010年底裝備了西門子ADVIA Centaur化學(xué)發(fā)光儀。盡管比較化學(xué)發(fā)光儀和放射免疫檢測激素的研究已甚多，但有關(guān)CP發(fā)光儀檢測激素的研究目前不多。因此本研究通過RIA和CP同時檢測了52份胰島素標(biāo)本，對西門子化學(xué)發(fā)光儀CP檢測結(jié)果進(jìn)行分析和評價。

材料與方法

1.研究對象:筆者醫(yī)院2011年6～7月胰島素標(biāo)本52份，其中男性25人，女性27人，患者平均年齡59.3歲。

2.試劑和設(shè)備:RIA使用的設(shè)備為中佳合肥科技有限公司生產(chǎn)的γ計數(shù)儀，試劑由山東濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司提供，批號20110720。CLIA檢測設(shè)備為西門子公司生產(chǎn)的CP化學(xué)發(fā)光儀，試劑使用西門子公司原裝胰島素試劑，試劑批號:066077。

3.研究方法:所有患者用真空干燥管靜脈采血，室溫下3800r/min離心15 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。RIA和CLIA均由操作熟練的專門技術(shù)人員操作。測定前先做質(zhì)控品，每次測試均帶陽性對照、陰性對照和標(biāo)準(zhǔn)品，以保證檢測結(jié)果的可靠性。

放免法檢測基本原理為競爭性放射免疫分析法。血清中的胰島素和試劑中125I-胰島素抗原同時與試劑中的胰島素抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。加入免疫分離劑，將免疫復(fù)合物沉淀出來，離心后，抽棄上清，用γ計數(shù)儀測量沉淀的放射性計數(shù)(cpm)。血清中胰島素含量越高，試管中cpm值越低，二者呈現(xiàn)反比關(guān)系?；瘜W(xué)發(fā)光法原理為直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)。即第一抗體為吖啶酯標(biāo)記的單克隆鼠抗胰島素抗體，二抗為固相試劑內(nèi)共價偶合到順磁性微粒上的單克隆鼠抗胰島素抗體。血清中的胰島素與吖啶酯標(biāo)記的一抗結(jié)合，然后加入固相二抗。血清內(nèi)胰島素再與固相內(nèi)二抗結(jié)合，分離未結(jié)合的一抗，啟動化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，血清中的胰島素的含量與系統(tǒng)檢測的相對光單位(RLUs)數(shù)量呈現(xiàn)一定的直線關(guān)系。

4.統(tǒng)計學(xué)方法:經(jīng)過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，本組胰島素實驗結(jié)果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故使用中位數(shù)表示兩種方法檢測結(jié)果。Wilcoxon配對符號的秩和檢驗比較兩種方法檢測結(jié)果的差異，Spearman統(tǒng)計表示兩種方法的相關(guān)性。

結(jié) 果

1.RIA和CLIA檢測結(jié)果比較:為了比較兩種檢測方法之間有無差異，我們同時用RIA和CLIA法測試了52個標(biāo)本內(nèi)胰島素含量，通過Wilcoxon配對符號的秩和檢驗比較二者之間有無顯著性差異。RIA和CLIA檢測胰島素的中位數(shù)分別為33.48和27.50(Z=-3.23，P＜0.01)，認(rèn)為兩種方法檢測結(jié)果之間有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.兩種方法之間的相關(guān)性研究:為了比較CLIA和RIA檢測胰島素結(jié)果之間有無相關(guān)性，我們用Spearman檢測兩種方法的相關(guān)性，用散點圖表示結(jié)果(圖1)。Spearman相關(guān)系數(shù)為0.845，認(rèn)為兩種方法檢測結(jié)果具有高度相關(guān)性(P＜0.01)。散點圖相關(guān)系數(shù)為0.92，與Spearman結(jié)果一致，認(rèn)為兩種方法之間高度相關(guān)(P＜0.05)。

圖1 RIA和CLIA檢測胰島素結(jié)果散點圖(R2=0.92，P ＜0.01)

討 論

我們的實驗結(jié)果表明，應(yīng)用RIA和CLIA檢測同一份標(biāo)本，兩個結(jié)果之間有顯著性差異，但兩種方法檢測結(jié)果之間高度相關(guān)。

EIA、RIA和CLIA作為當(dāng)代蛋白質(zhì)定量檢測的3大技術(shù)，具有各自優(yōu)點和缺點。EIA具有試劑成本低，不需要特殊設(shè)備(如果要定量檢測需要酶標(biāo)儀，價格在5萬元以內(nèi)不等)，廢液不含放射性核素，對工作人員和環(huán)境污染比較小等優(yōu)點，在大型醫(yī)院和大部分基層與醫(yī)院均可使用，應(yīng)用范圍廣泛。EIA缺點是檢測靈敏度比較低(10-9g/L)，檢測微量蛋白質(zhì)或微量激素結(jié)果準(zhǔn)確性差［2，3］。近年來發(fā)展出來的全自酶聯(lián)分析儀是EIA方法實現(xiàn)了自動化，但全自動酶聯(lián)分析儀本身價格昂貴(100萬～200萬之間)，目前在廣大醫(yī)院難以普及。RIA方法的優(yōu)點是試劑成本低，檢測結(jié)果精確性比較高(10-15～ 10-12g/L)［4～6］，但需要γ計數(shù)儀(大約10萬～20萬元不等)。RIA缺點是:①125I等同位素對工作人員和環(huán)境產(chǎn)生的放射性污染;②125I半衰期比較短(60天)，試劑穩(wěn)定性比較差［7］。如果試劑未用完，第2次檢測必須重新做曲線，結(jié)果準(zhǔn)確性也會大大降低。CLIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、線性范圍寬、操作簡便，可實現(xiàn)全自動化的優(yōu)點［8］。應(yīng)用范圍廣泛，既可檢測抗原、半抗原和抗體，亦可檢測核酸。CLIA無輻射、標(biāo)志物有效期長，因此試劑穩(wěn)定性好［9，10］。缺點是試劑成本價高，需要特殊設(shè)備(設(shè)備價格30萬～150萬不等)。RIA和CLIA均需特殊設(shè)備，限制了兩種方法的使用，許多基層醫(yī)院均不能配備γ計數(shù)儀和化學(xué)發(fā)光儀，因此不能應(yīng)用這兩種方法。

筆者所在科室2010年配備了西門子化學(xué)發(fā)光儀。西門子化學(xué)發(fā)光儀系收購前德靈技術(shù)后開發(fā)出的產(chǎn)品。盡管目前比較RIA和CLIA的研究很多，但將CP檢測結(jié)果和RIA結(jié)果進(jìn)行比較并且評價的研究甚少。因此我們選擇52份血清，通過兩種方法進(jìn)行檢測，對其結(jié)果進(jìn)行評價。結(jié)果表明，CLIA和RIA檢測結(jié)果不一致，不一致的原因可能是由于:①兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)品不一致［11］;②化學(xué)發(fā)光法使用單克隆抗體，放免法使用多克隆抗體。單克隆抗體和多克隆抗體敏感性和特異性不一致;③兩種試劑盒分別由不同的廠家生產(chǎn)，使用的抗體片段不完全一致。但兩種方法具有高度相關(guān)性，因此測試結(jié)果具有一定的可靠性。由于條件的限制，無論RIA、CLIA還是EIA均非測定胰島素的金標(biāo)準(zhǔn)，相互之間對比缺少標(biāo)準(zhǔn)參考條件，限制了CLIA評價的準(zhǔn)確性。

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