白細胞介素10-1082G/A位點單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌的相關性

陳占國 何 杰 周 武 余志賢 吳秀玲 陶志華

在我國的泌尿系腫瘤中，膀胱腫瘤不論是發(fā)生率還是病死率均居首位。研究表明，膀胱腫瘤與環(huán)境因素和遺傳因素密切相關。IL-10是細胞因子網絡中為數不多的免疫抑制因子，具有下調炎癥反應的作用。有證據表明IL-10可能參與了膀胱癌的發(fā)病機制［1～3］。IL-10的產生與其基因啟動子多態(tài)性密切相關，IL-10基因啟動子區(qū)域存在3個SNP位點(-1082G/A、-819C/T和-592 C/A)，其基因型決定血清IL-10的表達量，IL-10基因啟動子多態(tài)性可能與膀胱癌遺傳易感性有關。目前，國內尚無相關報道，國外僅見印度北方人群IL-10基因啟動子多態(tài)性與膀胱腫瘤遺傳易感性的研究報道，且不同地區(qū)不同人種IL-10基因啟動子SNP位點等位基因頻率可能存在差異。本研究采用等位基因特異性擴增(AS-PCR)結合DNA測序方法，檢測浙江漢族人群IL-10基因啟動子-1082G/A多態(tài)性位點，探索IL-10基因啟動子-1082G/A多態(tài)性與膀胱癌的相關性。

對象與方法

1.對象:(1)病例組400例膀胱癌，來自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科住院患者，2009年1月～2011年3月經病理確診，其中男性318例，女性82例，患者平均年齡63.05±10.15歲，吸煙者186例，不吸煙者214例;上述病例均為初診膀胱癌患者，不包括膀胱癌復發(fā)患者，未經化療、放療，并且無任何其他腫瘤病史;腫瘤組織病理診斷為膀胱移行細胞癌，其中淺表性(Ta期～T1期)為278例，浸潤性(T2期～T4期)為122例。(2)對照組400例，來自同期健康體檢者，其中男性316例，女性84例，平均年齡62.88±9.52歲，吸煙者180例，不吸煙者220例，無慢性疾病、無泌尿系統(tǒng)疾病、無任何惡性腫瘤家族史，最終排除診斷膀胱腫瘤及其他部位惡性腫瘤。為了具有可比性，病例組和對照組均為浙江漢族人群，彼此之間無血緣關系，年齡、性別構成比相近。全部研究對象經筆者醫(yī)院倫理委員會同意，簽署知情同意書。

2.主要儀器與試劑:Mastercycler PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)、DU?800紫外分光光度儀(Beckman-Coulter公司)、DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)、WD-9413B凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)、血液基因組DNA提取試劑盒和2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)、DNA Marker(MBI Fermentas公司)。

3.方法:(1)基因組DNA制備:抽取患者靜脈血2ml(EDTA-K2抗凝)，采用血液基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA(離心柱式提取)，嚴格按試劑盒說明書操作，用DU?800紫外分光光度儀進行純度和DNA定量分析，將DNA溶液稀釋至20ng/μl，-20℃儲存?zhèn)溆谩?2)引物設計與合成:利用PCR引物的3'端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計等位基因特異性 PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3'堿基與模板配對時才能出現PCR擴增帶，從而檢測出突變，該法省去了探針雜交操作;IL-10基因啟動子位點-1082G/A的PCR引物參照文獻［4］設計，見表1。引物設計完成后，進行BLAST同源性檢索，與其他基因無同源性。同時，合成內參引物一對。引物由上?；瞪锛夹g有限公司合成。(3)PCR擴增:IL-10-1082G/A位點的PCR擴增總體積 25.0μl，其中含 2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，10μmol/L 上游 引物 0.75μl，10μmol/L 下游 引物0.75μl，DNA 模板1μl，滅菌雙蒸水10μl;IL-10-1082G/A 位點的擴增循環(huán)條件:94℃預變性 1min，95℃ 15s、65℃ 50s、72℃ 40s，共 10 個循環(huán);95℃ 20s、62℃ 50s、72℃ 50s，共 20 個循環(huán)。每次PCR擴增均設立陰性對照和試劑空白。(4)IL-10-1082G/A位點基因型分析:根據特定的引物對是否能擴增出相應的片段，確定是否存在該等位基因，每個樣本同時經兩對引物(兩個PCR擴增體系)擴增確定基因型。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認基因型。內參引物反應體系參照IL-10-1082G/A位點的PCR擴增體系，用于驗證每一個所提取基因組DNA標本的有效性。通過對照電泳最終確認基因型。(5)測序驗證:為了提高AS-PCR檢測IL-10-1082G/A位點檢測的準確性，隨機盲樣抽取10%樣本，進行DNA測序，用于驗證AS-PCR的可靠性;采用膠回收試劑盒純化PCR產物，PCR產物純化和DNA測序交上海桑尼生物科技有限公司完成。

表1 IL-10基因啟動子-1082 G/A位點引物序列

4.統(tǒng)計學方法:Hardy-Weinberg平衡檢驗判斷所選取樣本的代表性;用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析;IL-10-1082G/A位點基因型頻率和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗;采用Logistic回歸分析判斷膀胱癌危險因素作用的大小，以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對危險度，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.病例組與對照組的一般情況的比較:膀胱癌病例組和健康對照組在年齡、性別比例、吸煙、飲酒等變量進行比較，分布差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。以上所有研究對象，均進行IL-10-1082G/A基因型檢測。

2.IL-10-1082G/A位點檢測結果及基因型確定:樣本分別經G和A引物對擴增后的陽性結果應為258bp;僅見G引物對擴增的片段為GG型，均見相應的片段為GA型，僅見A引物對擴增的片段為AA型;IL-10-1082G/A位點基因型的電泳結果見圖1;隨機盲樣抽取10%樣本，進行DNA測序，測序結果與AS-PCR檢測的基因型完全一致，證實ASPCR檢測結果是可靠的，測序結果見圖2。

表2 膀胱癌組與對照組的一般情況的比較［n(%)］

圖1 AS-PCR法擴增IL-10-1082G/A位點的基因型

3.IL-10-1082G/A基因型和等位基因頻率的分布:膀胱癌組和對照組IL-10-1082G/A的基因型和等位基因頻率分布結果，見表3。經χ2檢驗，膀胱癌組和對照組IL-10-1082G/A SNP位點基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明其基因頻率已達到遺傳平衡(P＞0.05)，說明所選取病例組和對照組的人群，具有良好的代表性。膀胱癌組和對照組中基因型比例從高到低分別為AA型＞GA型＞GG型，兩組在基因型分布和等位基因頻率之間的差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=8.375，P＜0.05和 χ2=8.322，P＜0.01)。

圖2 IL-10-1082G/A基因型GG型、AG型及AA型的測序圖譜(A、B、C)

表3 膀胱癌組和對照組IL-10-1082G/A的基因型和等位基因頻率分布［n(%)］

4.IL-10-1082G/A基因型和等位基因與膀胱癌風險性的關系:因GG型例數較少，且與GA型之間沒有統(tǒng)計學差別，故將GG型和GA型合并;AA基因型的個體與攜帶G基因型的個體(GG型和GA型)相比，其患膀胱癌危險性增加2.055倍(OR=2.055，95%CI:1.252～ 3.374)(χ2=8.375，P ＜0.01);攜帶等位基因A的個體與攜帶等位基因G的個體相比，其患膀胱癌危險性增加1.990倍(OR=1.990，95%CI:1.237～ 3.203)(χ2=8.322，P ＜0.01)，見表 4。

表4 IL-10-1082G/A基因型和等位基因與膀胱癌的相關性分析［n(%)］

5.IL-10-1082G/A基因型與膀胱癌臨床分期的關系:GG型、GA型、AA型在淺表性膀胱癌的分布頻率分別為0.4%、5.4%、94.2%，在浸潤性膀胱癌的分布頻率分別為0%、8.2%、91.8%，將GG型和GA型合并為一組，GG+GA基因型與AA基因型在淺表性膀胱癌與浸潤型膀胱癌之間差異均無統(tǒng)計學意義，見表5。

表5 IL-10-1082G/A基因型膀胱癌臨床分期的關系［n(%)］

討 論

研究表明，膀胱癌與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關，遺傳因素和環(huán)境因素相當于腫瘤發(fā)生的內在因素和外在因素，腫瘤的發(fā)生是兩者共同作用的結果。SNPs是人類基因變異的最普通形式，可能有助于解釋不同個體對多種疾病包括癌癥的易感性差異。DNA序列中單核苷酸的變異，尤其是基因啟動子的突變可能既影響基因表達又能影響酶的活性，就較容易和癌癥危險性聯系起來。目前已有大量的研究探討了Ⅰ、Ⅱ相藥物代謝酶基因、DNA修復基因多態(tài)性與腫瘤易感性的關系［5，6］，這些基因 SNPs與膀胱癌易感性之間存在一些聯系，并認為其可能是造成不同個體對所暴露環(huán)境因素反應差異的重要原因之一。

近年來，在尋找膀胱癌相關基因時，白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)基因備受關注。IL-10是一種具有多種免疫抑制及刺激功能的重要免疫調節(jié)因子，與炎癥疾病、自身免疫性疾病以及移植等多種疾病密切相關。IL-10具有明顯的抗炎癥作用，IL-10表達量的減少會導致前炎癥介質增加，長期過量地產生前炎癥介質對于促進腫瘤生長和發(fā)展起重要的影響，易形成腫瘤發(fā)生和發(fā)展的適宜微環(huán)境。IL-10還可通過下調MHC-Ⅰ表達來抑制腫瘤生長，進而增強自然殺傷細胞(NK細胞)介導的腫瘤殺傷作用。由此可見，IL-10能明顯抑制腫瘤的發(fā)生。有研究表明，IL-10參與了膀胱癌的發(fā)病機制［1～3］。IL-10能明顯抑制腫瘤的發(fā)生。個體表達IL-10的能力主要取決于其遺傳背景。產生IL-10的能力顯著不同，其根源在于IL-10基因啟動子區(qū)的多態(tài)性。IL-10基因位于第1號染色體1q31～32，含有5個外顯子和4個內含子。IL-10基因的啟動子區(qū)域有3個多態(tài)位點(-1082 G/A、-819C/T、-592 C/A)，導致其mRNA合成率不同，影響IL-10基因表達。啟動子區(qū)域多態(tài)性與IL-10表達水平密切相關，這些基因多態(tài)性處于強烈的連鎖不平衡狀態(tài)，3個多態(tài)性位點組成了3種單體型(即 GCC、ACC、ATA)，IL-10基因啟動子的各基因型分別對應不同的IL-10分泌水平:GCC/GCC為高分泌型，GCC/ACC和 GCC/ATA為中分泌型，ACC/ACC、ACC/ATA和ATA/ATA為低分泌型［7］。

Ahirwar等［8］首次報道北印度人IL-10的基因多態(tài)性和膀胱癌遺傳易感性的關系，結果顯示在膀胱癌病例組中，IL-10-1082G/A基因型頻率高低依次為:GA型(52.3%)＞AA型(39.3%)＞GG型(8.4%);在正常對照組中，該SNP位點的基因型頻率高低依次為:GA型(47.0%)＞AA型(37.2%)＞GG型(15.8%);其結論是IL-10-1082G/A多態(tài)性位點攜帶A等位基因(GA+AA)，膀胱癌遺傳易感性增高。本研究對浙江漢族人群IL-10-1082G/A位點SNP與膀胱癌風險性的關系進行了分析。結果顯示，病例組和對照組的AA型比例很高，即在膀胱癌病例組中，基因型頻率高低依次為:AA型(93.5%)＞GA型(6.25%)＞GG型(0.25%);在正常對照組中，該SNP位點的基因型頻率高低依次為:AA型(87.5%)＞GA型(12.0%)＞GG型(0.5%);IL-10-1082G/A位點的基因型頻率和等位基因頻率在病例組和對照組間差異存在統(tǒng)計學意義(χ2=8.375，P＜0.01和 χ2=8.322，P ＜0.01)。GG 型在病例組和對照組少見，將GG型GA合并為一組(GG+GA組);對所有樣本進行Logistic回歸分析，與攜帶G基因的個體(即GG+GA)相比，AA基因型的個體患膀胱癌的風險增加2.055倍(OR=2.055，95%CI:1.252～3.374)(P＜0.01);與攜帶等位基因G的個體相比，攜帶等位基因A的個體患膀胱癌的風險增加1.990倍(OR=1.990，95%CI:1.237～3.203)(P＜0.01)?？梢?，IL-10-1082G/A位點的基因型AA與個體患膀胱癌的風險性相關。變異型基因型(AA)導致IL-10水平降低，由此推測，IL-10基因轉錄水平的降低可能影響膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展，IL-10可作為膀胱癌發(fā)生和發(fā)展的一個重要因素。

不同地區(qū)不同人種IL-10基因啟動子SNP位點等位基因頻率存在差異，IL-10基因多態(tài)性位點與不同類型的腫瘤和臨床結局密切相關。膀胱腫瘤按照病程進展分為淺表性膀胱癌和浸潤性膀胱癌，浸潤性膀胱癌病程進展迅速，患者預后差，而淺表性膀胱癌的顯著特點是頻繁復發(fā)，高達70%的患者將在短期內多次出現腫瘤復發(fā)，其中30%將進展為更高分期和分級的腫瘤。Ahirwar等［8］發(fā)現在高分級高分期的膀胱癌中，攜帶A等位基因的基因型(GA+AA)比例反而降低，這提示攜帶A等位基因的IL-10-1082G/A基因位點對膀胱癌有保護性。本研究結果顯示，浸潤性膀胱癌AA基因型比例低于淺表性膀胱癌，但兩組分布差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，該位點基因型與膀胱癌的臨床分期沒有直接相關。

等位基因特異性擴增法(AS-PCR)檢測IL-10-1082G/A基因啟動子多態(tài)性，該方法是Newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。其基本原理是:如果引物的3'端堿基與模板堿基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據已知點突變設計3條引物，其3'端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區(qū)分開來。此法已用于多種疾病的點突變的檢測。具有簡便、快速，省去探針雜交，檢測成本低等特點。本研究采用AS-PCR結合DNA測序方法檢測IL-10基因啟動子多態(tài)性位點，分析浙江漢族人群IL-10-1082G/A基因啟動子多態(tài)性與膀胱癌遺傳易感性的關系，以期為篩檢膀胱癌高風險人群提供科學依據。

總之，IL-10-1082G/A多態(tài)性與膀胱癌危險性密切相關，尤其在AA基因型個體中更高的患癌風險。IL-10-1082G/A多態(tài)性可能是膀胱癌的一個新的危險因素，可作為新的可能的膀胱癌分子標志物。IL-10-1082G/A位點基因型與膀胱癌的臨床分期沒有直接相關性。當然，膀胱癌的病因和病理生理機制是復雜多變的，不是單一基因多態(tài)性可以解釋的，對于其發(fā)病機制尚待進一步研究。另外，IL-10基因啟動子多態(tài)性與血清IL-10及TNF水平的相關性，正在進一步研究中。

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8 Ahirwar D，Mandhani A，Mittal RD.Interleukin-10 G-1082A and C-819T polymorphisms as possible molecular markers of urothelial bladder cancer［J］.Arch Med Res，2009，40(2):97-102