乙型肝炎病毒x基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞導致細胞凋亡的機制探討

王 軒 周 益 朱 楠 袁偉杰

乙型肝炎病毒(HBV)感染除了導致急/慢性肝炎、肝硬化、肝癌以外，還可以并發(fā)多種肝外損害，其中HBV相關(guān)性腎炎(HBV－GN)最為常見，其發(fā)病機制至今尚未完全闡明。于艷等［1］研究發(fā)現(xiàn)，HBV－GN患者腎小管上皮細胞中存在HBV x基因(HBx)mRNA的異常表達，提示HBx與腎小管上皮細胞的損傷凋亡密切相關(guān)。Toll樣受體4(TLR4)作為識別病原微生物的主要受體，可識別HBV，并抑制其復制;TLR4亦是一個損傷敏感性高度表達蛋白質(zhì)，在急性腎損傷中表達上調(diào)并誘導細胞凋亡［2］。據(jù)此，本研究以人近端腎小管上皮細胞系(HK－2細胞)為研究對象，將HBx瞬時轉(zhuǎn)染入細胞中，旨在觀察HBx對HK－2細胞TLR4表達及細胞凋亡、細胞因子分泌的影響。

材料與方法

主要材料 HK－2永生化細胞株由上海長征醫(yī)院梅長林教授饋贈。K－SFM無血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司，限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR V、Taq酶購自Takara公司;T4 DNA連接酶、感受態(tài)細菌TOP 10、DNA純化回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自TIANGEN公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000、Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，HBx抗體和TLR4抗體購自Abcam公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自Sigma公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技，AnnexinV、PI購自BD公司，白細胞介素4(IL－4)ELISA kit、干擾素 γ(IFN－γ)elisa kit購自sunteam公司。

實驗方法

質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)GenBank中ayr亞型HBV基因組序列，設計HBx基因的引物，其引物上、下游分別包含有Kpn I和EcoR V內(nèi)切酶酶切位點(畫線處為酶切位點)，上游引物為5’－GGGGTACCGTGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC－3’，下游引物為5’－GCCGATATCCTAACATTGAGATTCCCGAG－3’擴增純化HBx基因片段，將純化得到的 HBx片段與pcDNA3.1/myc質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和EcoR V進行雙酶切，于瓊脂糖凝膠上電泳、回收純化酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃過夜連接后，轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細胞，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒進行雙酶切和DNA測序鑒定。

細胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的HK－2細胞，迅速復蘇后置于K－SFM無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，隔天換液，細胞貼壁生長，密度達80%時，0.25%胰酶消化傳代。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細胞，以8×105/孔接種至六孔板，K－SFM無血清培養(yǎng)基中37℃，5%CO2貼壁培養(yǎng)過夜。真核表達質(zhì)粒用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程參照LipofectamineTM2000說明進行。步驟簡述如下:(1)將一定量的HBx質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒溶于一定量的Opti－MEM I中，輕柔混勻(使用的量根據(jù)說明書計算獲得);(2)稀釋一定量的Lipofectamine 2000至一定量的Opti－MEM I中，室溫孵育5 min;(3)將二者混勻，室溫孵育20 min;(4)每孔加入混合物和一定量的Opti－MEM I，輕柔混勻，37℃孵育6h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。實驗分為三組:未處理細胞組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1b/myc質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1b/myc－HBx 質(zhì)粒組。

RT－PCR驗證HBx轉(zhuǎn)染、檢測TLR4 mRNA水平

用Trizol提取RNA，RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA模板于包含有ddH2O、10×反應緩沖液、dNTP、SYBR Premix EX Taq、DNA聚合酶和引物的PCR混合液中擴增。HBx及TLR4特異性引物序列見表l。熱循環(huán)體系:95℃變性30s，接著40個循環(huán)包括95℃變性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s。溶解曲線分析:溫度從60℃以0.2℃/s的速度升至95℃，用于評估擴增的特異性。各樣本HBx基因的擴增結(jié)果用 GAPDH的濃度校正。2－△△CT法計算HBx mRNA、TLR4 mRNA的倍數(shù)變化。

表1 各基因引物序列

Western Blot驗證質(zhì)粒特異性、檢測TLR4水平

蛋白樣品收集 將培養(yǎng)的細胞吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩次后，加入2×細胞裂解液用槍頭攪動以充分裂解細胞，95℃水浴加熱10 min，立刻置于冰上，可立即使用或儲存于－70℃。用BCA試劑盒(PIERCE)進行蛋白質(zhì)定量，取合適量的裂解液加入等體積2×蛋白上樣緩沖液，95℃水浴變性10 min，即可用于 Western Blot分析，或儲存于 －70℃冰箱。

蛋白印跡 (1)電泳:SDS－PAGE電泳，80V 30 min，160V 50 min左右。(2)轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后，將凝膠移入轉(zhuǎn)膜緩沖液固定3～5 min。硝酸纖維素膜先用ddH2O浸濕后再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡。按轉(zhuǎn)膜電極板陰極至陽極方向，依次疊放濾紙、電泳凝膠、膜及濾紙。去除各層間的殘留氣泡，濕轉(zhuǎn)儀(Invitrogen)30V轉(zhuǎn)膜35 min。(3)轉(zhuǎn)膜完畢后將膜置入含5%(w/v)脫脂奶粉的PBST中，室溫下封閉1 h。(4)用封閉液稀釋一抗，室溫下反應2 h，或4℃反應過夜，用PBST洗滌3次，5 min/次。(5)用封閉液稀釋熒光二抗，室溫下反應30 min，用PBST洗滌3次，5 min/次。(6)用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(LI－COR Biosciences)掃描硝酸纖維素膜。

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染24h后的HK－2細胞以及未轉(zhuǎn)染的對照組細胞用0.25%胰酶消化后收集細胞，每管細胞數(shù)1×105/100 μl，經(jīng) PBS洗滌2次，用凋亡檢測Buffer洗滌一次，分別加入5 μl AnnexinV 和10 μl PI，室溫孵育15 min后，再加入凋亡檢測Buffer 400 μl，上FACS流式細胞儀檢測后，用CELLQuest軟件進行數(shù)據(jù)分析。

ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL－4、IFN－γ水平取對數(shù)生長期的三組細胞，以2.5×106/孔接種至六孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，收集細胞培養(yǎng)上清，－80℃保存。按照ELISA試劑盒要求操作，酶標儀450 nm處各孔A值，根據(jù)標準曲線及A值計算各待測樣本的濃度值。

統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果均用均數(shù)±標準差表示，兩組間均值比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

質(zhì)粒圖及質(zhì)粒驗證 所構(gòu)建的質(zhì)粒圖如圖1所示，菌液PCR鑒定，采用T7/BGH測序引物鑒定，序列正確，產(chǎn)物長度應為700 bp。結(jié)果表明挑選的4個克隆都為陽性(圖1)。

圖1 質(zhì)粒圖及質(zhì)粒驗證圖

瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒后 HK－2細胞中HBx的表達鑒定選取轉(zhuǎn)染24h后的細胞為研究對 象，RT－PCR 結(jié) 果 顯 示 (圖 2A)，轉(zhuǎn) 染pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒后 HK－2 細胞可見 HBx 表達，而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1/myc的HK－2細胞中未見 HBx表達。Western blot檢測結(jié)果顯示(圖2B)，轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－HBx 質(zhì)粒的 HK－2 細胞中可見HBx表達，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染HBx基因的HK－2細胞未見HBx表達。

顯微鏡觀察 pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后HK－2細胞的形態(tài) 顯微鏡下觀察，正常未處理的細胞貼壁良好，呈“鋪路石”樣，細胞數(shù)量較多，折光性好;轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/myc質(zhì)粒后，細胞數(shù)量有所減少，細胞貼壁、折光性下降;轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒后，細胞數(shù)量明顯下降，細胞形態(tài)不規(guī)則，貼壁率、折光性下降，細胞中有較多的顆粒，細胞狀態(tài)受損(圖3)。

各組HK－2細胞中TLR4的表達 RT－PCR結(jié)果(圖4A)顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc細胞組和未處理細胞組中TLR4均呈低表達，轉(zhuǎn)染HBx基因組較前兩組細胞中TLR4 mRNA表達明顯增加(P＜0.05)，前兩組TLR4的水平無明顯差異。Western Blot結(jié)果(圖4B)和RT－PCR結(jié)果一致，轉(zhuǎn)染 HBx基因組中TLR4蛋白表達水平較兩組對照組明顯上調(diào)(P ＜0.05)。

各組細胞凋亡情況 用Annexin V和PI雙染的方法，流式細胞儀測定細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒的HK－2細胞凋亡率為14.94% ±0.32%，較對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc質(zhì)粒的 HK－2細胞 13.67% ±0.54%明顯增加(P＜0.05)，較未處理的細胞13.86% ±0.18%增加(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/myc質(zhì)粒組和未處理組細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(圖5)。

各組細胞培養(yǎng)上清中 IL－4、IFN－γ水平 ELISA結(jié)果顯示(圖6)轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒組IL－4水平(24.97±12.04)，明顯低于未處理細胞組(63.80±8.50)和轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc質(zhì)粒組(60.11±7.58)(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒組IFN－γ水平(16.32 ±2.52)明顯高于未處理細胞組(12.08±0.75)和轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1/myc質(zhì)粒組(12.73±2.96)(P＜0.05)。

圖5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率

圖6 ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-4、IFN-γ水平

討 論

我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，HBV－GN已成為我國主要的繼發(fā)性腎臟疾病之一，但由于HBV結(jié)構(gòu)、感染方式、免疫特性等因素的復雜性，至今HBV－GN發(fā)病機制仍不完全清楚。HBV具有明顯的種屬特異性，僅感染人類和某些靈長類細胞，且HBV體外感染細胞持續(xù)時間短，穩(wěn)定性差，給建立HBV感染細胞模型及進一步進行相關(guān)研究帶來很大的困難。由于HBx基因在HBV感染相關(guān)疾病發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用［3］，因此探討HBx基因片段功能可為更好地揭示HBV感染的發(fā)病機制提供新的實驗途徑。本研究以中國人易感染型HBV adr亞型中基因片段HBx作為基因來源，選擇真核表達載體pcDNA3.1/myc作為母載體，構(gòu)建了質(zhì)粒 pcDNA3.1/myc－HBx，并經(jīng)酶切、測序等鑒定，表明pcDNA3.1/myc－HBx質(zhì)粒構(gòu)建成功。由于所使用的人近端腎小管上皮細胞系HK－2較易進行轉(zhuǎn)染，故本研究采用脂質(zhì)體介導的瞬時轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1/myc－HBx 轉(zhuǎn)染入HK－2細胞，通過RT－PCR及Western Blot方法驗證了HBx基因在HK－2細胞中的表達，表明已成功的建立HBx轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞模型，這為后續(xù)細胞損傷及凋亡研究奠定了基礎(chǔ)。

HBx基因轉(zhuǎn)入HK－2細胞后，細胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，貼壁率及折光率下降，且細胞中出現(xiàn)較多的顆粒。我們前期研究結(jié)果亦顯示，HBV感染后腎小管上皮細胞，形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)較多的細胞碎片，且細胞融合現(xiàn)象顯著。提示HBV成分感染細胞后可導致細胞形態(tài)及生物學特性受損［4］?，F(xiàn)已明確，HBx基因轉(zhuǎn)入細胞后，HBx蛋白能夠誘導線粒體滲透性改變，使鈣離子內(nèi)流至細胞質(zhì)，激活鈣離子依賴的激酶途徑，促進HBV－DNA的復制，損傷組織細胞［5］。HBx 也可通過活化蛋白 1(AP－1)、AP－2、轉(zhuǎn)錄活化因子/環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(ATF/CREB)、核因子 κB(NF－κB)、活化的 T 細胞核因子(NF－AT)等多重順式元件及腎素血管緊張素系統(tǒng)/促分裂原活化蛋白激酶(RAS/MAPK)、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)、C－Jun氨基末端激酶(JNK)等多個信號轉(zhuǎn)導途徑激活轉(zhuǎn)錄，促進病毒復制［6］。然而，HBx基因的轉(zhuǎn)入雖使腎小管上皮細胞形態(tài)受損，但其具體機制尚不明確。

HBx是HBV復制所必需的轉(zhuǎn)錄因子，具有反式激活作用，不僅能通過調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子，促進病毒的復制，損傷細胞［7］，亦能通過蛋白與蛋白之間的相互作用參與細胞的增生和凋亡［8］。HBx引起的細胞過度凋亡是HBV持續(xù)感染肝組織致肝臟纖維化及肝癌發(fā)生的重要機制之一［9］。本研究在HBx轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞基礎(chǔ)上，采用流式分析術(shù)檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HBx基因后，與對照組相比，細胞的凋亡率明顯上升。我們曾在HBV－GN患者腎組織中發(fā)現(xiàn)Bcl－2和Bax表達顯著升高，提示HBV－GN中存在細胞凋亡［10］。當細胞大量凋亡超過吞噬細胞的清除能力時，可導致大量凋亡小體的聚集、降解和前炎癥內(nèi)容物的釋放，引起前炎癥因子腫瘤壞死因子 α(TNF－α)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF－β)等產(chǎn)生。有研究證實，HBx誘導腎小管上皮細胞的過度凋亡可導致腎小管間質(zhì)纖維化［11］。

我們體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)HBV－GN患者腎組織中有TLR4表達異常，且主要分布于腎小管上皮細胞及間質(zhì)組織，參與腎組織病變的進展［12］。體外實驗證實HBV感染腎小管上皮細胞后TLR4表達明顯增加［4］。本研究采用 RT－PCR及 Western blotting檢測各組細胞TLR4的表達水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HBx基因后TLR4的表達水平與對照組相比明顯上升，提示HBx蛋白具備調(diào)節(jié)TLR4生成的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)TLR4表達水平較高的組，細胞的凋亡率亦較高，細胞的凋亡率與TLR4水平有相關(guān)性。由此推測HBx促進細胞凋亡發(fā)生可能與其引起TLR4的表達上調(diào)有關(guān)。TLR4是一種模式識別受體，可表達于腎小管上皮細胞表面，其能識別多種病毒，啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，激活I(lǐng)L－6、TNF－α等相關(guān)炎癥因子的表達，誘發(fā)細胞內(nèi)的炎癥反應，導致細胞損傷或細胞凋亡;TLR4也能通過MyD88途徑激活NF－κB，引起后續(xù)生物學反應。據(jù)郝誠誠［13］等報道，大鼠過度訓練動物模型中腎小管上皮細胞TLR4表達上調(diào)，上調(diào)的TLR4激活周圍炎性細胞上的Fas配體，被激活的Fas配體與腎小管上皮細胞表面的Fas蛋白相互作用，激活Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)/Caspase－8信號轉(zhuǎn)導通路從而導致細胞凋亡。肝細胞表面TLR4誘發(fā)失控性炎癥產(chǎn)生的細胞毒作用亦可引起肝細胞通過FasL凋亡機制發(fā)生凋亡［14］。在人腎小管上皮細胞中TLR4以何種途徑介導HBx對腎小管上皮細胞凋亡作用還需進一步研究。

目前研究認為HBx引起TLR4激活后，可啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路，誘導特異性基因表達，分泌多種促炎癥細胞因子，誘導炎癥發(fā)生，促進T輔助細胞(Th)發(fā)生 Th1/Th2格局變化［15］。本研究中用ELISA方法檢測了細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL－4、IFN－γ水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HBx基因后腎小管上皮細胞分泌 IL－4、IFN－γ 異常，即 HBx 抑制了 IL－4 分泌，增強IFN－γ分泌，導致 IL－4/IFN－γ水平失衡。而細胞因子的類別及細胞因子之間的平衡對Th0細胞分化為Th1/Th2具有重要的調(diào)節(jié)作用。Th2細胞的分化依賴IL－4，而IFN－γ可以抑制Th2細胞的增生，使分化朝著Th1細胞方向發(fā)展，因此，IL－4和IFN－γ之間的平衡影響著Th1/Th2細胞之間的平衡，Th1/Th2細胞之間的失衡參與了慢性HBV感染過程［16］。根據(jù)本研究結(jié)果，HBx基因引起 IL－4、IFN－γ異常，可能由此引起 Th1/Th2細胞失衡，參與 HBV－GN的進展。

綜上所述，HBx在體外轉(zhuǎn)染腎小管上皮細胞后，可引起腎小管上皮細胞損傷，細胞凋亡率增加，這可能與HBx引起TLR4上調(diào)有關(guān)。HBx亦能引起一些細胞因子分泌紊亂，參與腎臟的損傷。進一步的相關(guān)機制的研究必將為臨床治療HBV－GN提供新的治療靶點。

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