鵝細(xì)小病毒vp2基因工程亞單位疫苗的免疫試驗(yàn)

摘要：為研究鵝細(xì)小病毒（GPV）VP2蛋白基因工程亞單位疫苗對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫效果，本試驗(yàn)對GPV延邊分離株的vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，將Western-blot試驗(yàn)鑒定為陽性的表達(dá)蛋白進(jìn)行乳化，免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用ELISA方法監(jiān)測試驗(yàn)動(dòng)物的體液免疫水平，以此評價(jià)該疫苗的免疫效果。結(jié)果表明，在三免后2d，重組蛋白佐劑組檢測到的血清OD450nm值達(dá)0.687，而生理鹽水陰性對照組為0.038，兩者差異極顯著（P<0.01），提示本研究制備的基因工程亞單位疫苗在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了VP2抗體水平。

關(guān)鍵詞：鵝細(xì)小病毒；基因工程亞單位疫苗；免疫試驗(yàn)

中圖分類號：S835文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1674-0432（2012）-01-0171-1

基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（201215230），吉林省牧業(yè)管理局項(xiàng)目(吉牧科字第200902號)。

細(xì)小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，發(fā)病率和病死率均較高，臨床一旦發(fā)病，無有效的治療辦法，嚴(yán)重危害本地區(qū)養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展[1]。目前，國內(nèi)外用于GP的預(yù)防主要以傳統(tǒng)疫苗為主，基因工程疫苗尚屬探索階段，尚缺乏GPV基因工程疫苗誘導(dǎo)雛鵝細(xì)胞免疫和體液免疫的系統(tǒng)研究資料。在GPV的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，Le Gall-Recule等[2]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，證明表達(dá)的番鴨細(xì)小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究擬對GPV的vp2基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備基因工程亞單位疫苗，并進(jìn)行免疫試驗(yàn)分析，為GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠購自哈爾濱獸醫(yī)研究所；弗氏佐劑購自sigma公司；其他載體與試劑由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 GPV延邊株vp2基因工程亞單位疫苗的制備

采用常規(guī)方法提取GPV延邊株的基因組DNA，以特異引物[3]擴(kuò)增vp2基因片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-vp2，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，將Western-blot鑒定為陽性的蛋白進(jìn)行親和層析純化，純化后重組蛋白與弗氏佐劑混合乳化，制備GPV的基因工程亞單位疫苗。

1.3 vp2基因工程亞單位疫苗的動(dòng)物免疫試驗(yàn)

免疫試驗(yàn)共分3組，每組10只BALB/c小鼠，分別為接種VP2重組蛋白組，VP2重組蛋白加佐劑組和生理鹽水對照組。在每一次免疫前采血分離血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分別采血分離血清，均存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA監(jiān)測血清VP2抗體水平

用純化的VP2重組蛋白為抗原包被反應(yīng)孔，以小鼠抗GPV陽性血清為一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測實(shí)驗(yàn)小鼠血清中抗體水平，并分析vp2基因工程亞單位疫苗對實(shí)驗(yàn)小鼠的體液免疫水平。采用SAS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 GPV vp2基因的原達(dá)表達(dá)

對pET30a-vp2進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE與Western-blot試驗(yàn)表明，在經(jīng)考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE膠上和NC膜上均出現(xiàn)VP2特異性條帶（圖略），百未誘導(dǎo)的重組菌未出現(xiàn)特異條帶。

2.2 GPV重組VP2蛋白的體液免疫水平

對采集的BALB/c免疫小鼠血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測，每個(gè)樣品重復(fù)檢測三次，取平均值計(jì)算，詳見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，在三免后第2d，重組蛋白組和重組蛋白佐劑組免疫小鼠血清的OD450nm值均達(dá)到最高值，重組蛋白佐劑組與生理鹽水陰性對照組間差異極顯著（P<0.01），而重組蛋白佐劑組與重組蛋白組間差異顯著（P<0.01）。

表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗體消長變化（OD450）

組別一免前二免前三免前三免后2d三免后4d三免后6d

重組蛋白組0.039±

0.0150.312±0.0120.434±0.0220.536±0.0310.480±0.0360.245±

0.017

重組蛋白佐劑組0.033±

0.0320.498±0.0170.663±0.0280.687±0.0360.569±0.0370.461±

0.019

生理鹽水組0.037±

0.0130.031±0.0150.039±0.0150.038±0.0150.034±0.0150.030±

0.015

3 討論

本研究以GPV的vp2基因?yàn)槟康幕?，以pET30a為表達(dá)載體，在體外高效表達(dá)了VP2蛋白，經(jīng)重組蛋白免疫小鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有免疫活性，重組蛋白佐劑組與陰性組間血清抗體水平差異極顯著，說明vp2基因可以作為基因工程疫苗的候選基因，而重組蛋白佐劑組與重組蛋白組間血清抗體水平差異顯著，提示佐劑對基因工程亞單位苗的免疫效果影響較大。由于本研究只是初步的預(yù)試驗(yàn)，未進(jìn)行攻毒試驗(yàn)和鵝體內(nèi)試驗(yàn)，這將在下一步試驗(yàn)中予以開展。本研究結(jié)果為GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 方定一.小鵝瘟的介紹[J].中國獸醫(yī)雜志，1962，8:19-20．

[2] le Gall-Recule， Jestin V，Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol，1996，77(9):2159-2163.

[3] 胡曉靜，潘杰，陳進(jìn)喜，等.2株鵝細(xì)小病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，(23):262-265.

作者簡介：高旭(1977-)，男，吉林德惠人，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物病毒病分子生物學(xué)與免疫學(xué)。