反向遺傳技術(shù)應(yīng)用于牛輪狀病毒的應(yīng)用與展望

摘要：為進(jìn)一步探討了解牛輪狀病毒的生物學(xué)特性，分析反向遺傳技術(shù)在牛輪狀病毒中的應(yīng)用進(jìn)展，最后再對應(yīng)用這一技術(shù)的未來前景進(jìn)行初步展望。

關(guān)鍵詞：牛輪狀病毒；反向遺傳技術(shù)；應(yīng)用；展望

中圖分類號：R392文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1674-0432（2012）-01-0170-1

牛輪狀病毒(Bovine rotavirus，BRV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起犢牛急性腹瀉的主要病毒之一[1]。發(fā)生BRV感染之后多容易繼發(fā)引起細(xì)菌性感染，對犢牛的生命安全和生命質(zhì)量構(gòu)成很大的威脅，同時(shí)也給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對我國養(yǎng)牛業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重的影響。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，對牛輪狀病毒的生物學(xué)研究也越來越完善，反向遺傳技術(shù)的發(fā)展更是準(zhǔn)確的提供了獲得重組毒株制備疫苗的方法，從而為防治牛輪狀病毒提供了更有效的措施。本文通過對牛輪狀病毒的生物學(xué)、流行病學(xué)和其分離培養(yǎng)鑒定等內(nèi)容的研究，分析反向遺傳技術(shù)在牛輪狀病毒中的應(yīng)用情況，并展望其未來的發(fā)展?fàn)顟B(tài)，現(xiàn)將分析報(bào)告如下。

1 牛輪狀病毒的簡介

1.1 牛輪狀病毒的生物學(xué)特性

輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridase)輪狀病毒屬，是引起人和動(dòng)物急性胄腸炎的主要病原體之一[2]。其中A組RV感染是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的最主要因素，是發(fā)展中國家嬰幼兒發(fā)生致命性腹瀉的首要病因[2]。目前，臨床中尚沒有治療輪狀病毒感染的特效藥物，因此，對其疫苗的研究就成了一直備受關(guān)注的課題。BRV是引起犢牛嚴(yán)重腹瀉的主要因素，且其致死率較高，有報(bào)道表明，英國犢牛因牛輪狀病毒而引起腹瀉的發(fā)生率為60-80%[3]，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

BRV呈球形，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)出車輪樣形狀，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，耐熱耐酸耐堿，于20℃左右最為活躍，具有較強(qiáng)的季節(jié)性。直徑為65～75mm，無囊膜，有3層衣殼，具有雙層蛋白殼體。牛輪狀病毒為二十面體結(jié)構(gòu)，基因組由雙鏈RNA組成，有11個(gè)分節(jié)段，一個(gè)鏈編碼病毒的6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，另一個(gè)鏈編碼6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，決定了病毒的結(jié)構(gòu)和功能[3]，其中至少會(huì)有6個(gè)蛋白質(zhì)要與核糖核酸結(jié)合。

1.2 牛輪狀病毒的流行情況

全球的科研工作者陸續(xù)在猴、豬、狗、禽等多種幼齡動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒，逐漸認(rèn)識到輪狀病毒是引起幼齡動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原。隨著研究的深入，結(jié)合電泳圖差異，顯示可感染牛的是A、B和C群輪狀病毒，其中以A群的感染最為嚴(yán)重[3]。牛群中輪狀病毒的感染源主要為糞便，在牛感染病毒后1天便可以在其糞便中檢測到病毒的存在。感染病毒主要通過接觸、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)途徑傳播，感染的牛群發(fā)生持續(xù)性腹瀉，進(jìn)而脫水，短時(shí)間內(nèi)繼發(fā)大腸桿菌和沙門氏桿菌感染，14-21d后引發(fā)肺炎，最終死亡。目前，科學(xué)研究者多認(rèn)為接種疫苗是防御此病的最有效方法，另外，也有些報(bào)道表示使用適量的抗生素也可以起到一定緩解細(xì)菌性腹瀉的作用。

1.3 牛輪狀病毒的分離培養(yǎng)和鑒定

輪狀病毒分離培養(yǎng)比較困難，應(yīng)用易感細(xì)胞和胰蛋白酶處理是細(xì)胞培養(yǎng)分離輪狀病毒的關(guān)鍵，最初多采用原代細(xì)胞，后來易感細(xì)胞系恒河猴腎傳代細(xì)胞MA-104的引進(jìn)，成功的分離到適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)的多種動(dòng)物輪狀病毒細(xì)胞株[4]。牛輪狀病毒培養(yǎng)時(shí)需要加蛋白水解酶如胰蛋白酶或胰凝乳酶，消化后才能適應(yīng)細(xì)胞，且不需血清。通過VP6高價(jià)免疫血清或單克隆抗體建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)，檢測牛糞便以確定有無感染。VP7或VP4的單克隆抗體可以通過血清學(xué)檢測確定。

2 反向遺傳技術(shù)

反向遺傳學(xué)是指直接從生物的遺傳物質(zhì)來對其生命的本質(zhì)現(xiàn)象進(jìn)行闡述。在得到生物體的全部基因序列后人工處理，之后再組成有生命活性的個(gè)體。這一技術(shù)有利于對生物體功能結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究，從而研發(fā)新疫苗。反向遺傳包括RNA干擾技術(shù)、基因沉默技術(shù)、基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)等。通過使用反向遺傳技術(shù)對輪狀病毒中的某些重要的蛋白質(zhì)功能進(jìn)行鑒定，可以加深對輪狀病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)理的研究，從而獲得理想的弱毒株。反向遺傳技術(shù)推動(dòng)了研究病毒基因組的人工操作和病毒基因功能的進(jìn)程，具有準(zhǔn)確率高、毒力返毒率低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其也存在有一定的局限性。然而，目前對輪狀病毒疫苗的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室VP4、VP6、VP7三個(gè)基因階段，對于安全可靠的應(yīng)用在臨床中還需要得到更有效的發(fā)展。

3 展望

牛輪狀病毒是引起犢牛急性腹瀉的主要病毒之一，也是引起犢牛急性腹瀉的最主要病因，感染后容易繼發(fā)引起細(xì)菌性感染，從而引起犢牛死亡。牛輪狀病毒主要是通過消化道、呼吸道和接觸的方式進(jìn)行傳播，口服或經(jīng)腸道后，減毒疫苗可激發(fā)腸道黏膜免疫，防止腸道黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生感染，因此研制減毒疫苗對于預(yù)防BRV感染有著非常重要的意義。目前，國內(nèi)尚沒有成功研制出BRV口服減毒疫苗，傳統(tǒng)的篩選毒株效率低，反向遺傳技術(shù)于基因組水平改良重組，所以將成為獲得弱毒株的有效方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 王丹，宋玲玲，王洪梅.反向遺傳技術(shù)在牛輪狀病毒研究中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(12):7255-7257.

[2] 趙雅靜，高雪軍，劉晨鳴.輪狀病毒LLR疫苗株VP7基因的遺傳變異研究[J].中國生物制品學(xué)雜志，2008，21(12):1074-1079.

[3] 陳軍，楊彪，謝金鑫.牛輪狀病毒的流行情況及預(yù)防措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2011，2:195.

[4] 魏鎖成，馮若飛，鞏轉(zhuǎn)娣，田風(fēng)林.牛輪狀病毒的分離與細(xì)胞培養(yǎng)特性[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(31):71-75.

作者介紹：孫素麗（1975-），女，河南正陽人，河南省駐馬店市正陽縣蘭青鄉(xiāng)政府農(nóng)業(yè)中心助理畜牧獸醫(yī)師，研究方向：畜牧獸醫(yī)。