人膜蛋白CD81原核表達(dá)與純化

摘要：以高效原核表達(dá)載體pCold TF為載體骨架，應(yīng)用PCR、限制性酶切、連接等分子生物學(xué)方法，將pCold TF中的六聚組氨酸（HisTag）序列替換為限制性酶切位點(diǎn)SpeⅠ序列ACTAGT，構(gòu)建不含HisTag序列的新載體pL118.以此載體表達(dá)蛋白時(shí)，通過PCR引物在目的基因3′端添加HisTag以利于融合蛋白的純化以及融合蛋白中的Trigger Factor（TF）助溶蛋白的去除.應(yīng)用pL118對(duì)人膜蛋白CD81進(jìn)行原核表達(dá)與純化，并使用Factor Xa蛋白酶去除CD81融合蛋白中的TF助溶蛋白，獲得3′端含有HisTag的CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表達(dá)純化，為CD81靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81的功能奠定了基礎(chǔ).pL118載體的構(gòu)建以及CD81蛋白的表達(dá)純化為表達(dá)困難的基因?qū)崿F(xiàn)原核表達(dá)提供了一種新的思路和方法.

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關(guān)鍵詞：載體；人CD81；蛋白表達(dá)；純化

中圖分類號(hào)：Q816 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

pCold TF原核表達(dá)載體是一種插入蛋白可溶性標(biāo)簽的融合型冷休克表達(dá)載體，空載體融合表達(dá)的順序?yàn)榱劢M氨酸（HisTag）、Trigger Factor（TF）、蛋白酶切位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)序列.蛋白酶切位點(diǎn)依次為HRV 3C protease，Thrombin和Factor Xa，用于去除融合蛋白的可溶性標(biāo)簽.TF是一種原核的核糖體結(jié)合伴侶蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約4.8×104，它能夠促進(jìn)新生肽鏈的共翻譯折疊，與目的蛋白融合表達(dá)，提高目的蛋白的可溶性.載體上帶有冷休克表達(dá)系統(tǒng)，嚴(yán)格控制載體在低溫條件下才能表達(dá)目的蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)了目的蛋白的可溶性表達(dá).

人CD81是一種四跨膜的非糖基化膜蛋白，由胞內(nèi)的N端和C端、4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外小環(huán)和胞外大環(huán)4部分組成，相對(duì)分子質(zhì)量約2.6×104，在B細(xì)胞、T細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá).CD81參與細(xì)胞的粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有影響細(xì)胞增殖和分化等生物學(xué)功能［1］，是細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子［2］，并參與丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染宿主細(xì)胞，作為HCV的一個(gè)受體介導(dǎo)病毒顆粒進(jìn)入宿主細(xì)胞［3］，HCV包膜蛋白E2與CD81胞外大環(huán)相互結(jié)合實(shí)現(xiàn)HCV的感染［4-5］.針對(duì)CD81的靶向藥物及特異性抗體具有抑制HCV感染的潛在功能［6-7］，人膜蛋白CD81的原核表達(dá)與純化，為今后靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).

湖南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2012年

第8期朱海珍等：人膜蛋白CD81的原核表達(dá)與純化

pET28b是一種常規(guī)的原核表達(dá)載體，含有T7啟動(dòng)子、乳糖操縱子和多克隆位點(diǎn)序列等基本功能元件，在蛋白原核表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)體系中應(yīng)用廣泛.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將人cd81基因克隆到pET28b載體中嘗試原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒有可溶性目的蛋白的表達(dá).pCold TF不僅有pET28b中的基本功能元件，還包含了冷休克表達(dá)系統(tǒng)和TF助溶蛋白，通過嚴(yán)格控制目的蛋白低溫表達(dá)，以及TF的可溶性標(biāo)記功能和分子伴侶作用，可以使一些表達(dá)困難的基因獲得更高概率的可溶性表達(dá).本課題改造pCold TF載體，在保留冷休克及融合表達(dá)系統(tǒng)的前提下，去除原載體上的HisTag序列，一方面提高了人CD81蛋白融合表達(dá)的效率和可溶性，另一方面有利于融合蛋白中的TF助溶蛋白的去除，獲得不含助溶蛋白標(biāo)簽的全長(zhǎng)人CD81蛋白.

1 材料與方法

3 討論

pCold TF載體擁有冷休克表達(dá)系統(tǒng)和TF助溶蛋白，一些表達(dá)困難的基因在pCold TF中有更高概率的可溶性表達(dá).但是目的基因在pCold TF中表達(dá)得到的融合蛋白含有4.8×104的TF助溶蛋白標(biāo)簽，標(biāo)簽的分子質(zhì)量偏大，對(duì)目的蛋白結(jié)構(gòu)及功能有較大的影響，而去除TF卻不方便，因?yàn)槿诤系鞍妆磉_(dá)的順序?yàn)镠isTag、TF助溶蛋白、蛋白酶切位點(diǎn)、目的蛋白，利用蛋白酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切后，目的蛋白將和HisTag、TF助溶蛋白分開成為兩個(gè)蛋白片段，目的蛋白不含HisTag，不利于目的蛋白的再回收.本文對(duì)pCold TF載體進(jìn)行改造，使之不含HisTag序列，將目的基因克隆到該載體時(shí)，通過在目的基因3′端引物添加HisTag序列，其融合蛋白表達(dá)的順序?yàn)門F助溶蛋白、蛋白酶切位點(diǎn)、目的蛋白、HisTag，其中HisTag不僅可用于融合蛋白的純化，也可用于融合蛋白酶切后目的蛋白的純化，因?yàn)镠isTag仍然保留在目的蛋白上，也可作為標(biāo)簽用于Western blot中目的蛋白的檢測(cè)，以及結(jié)合在NiNTA等載體上，用于進(jìn)一步目的蛋白功能研究和特異性藥物篩選等.

通過對(duì)pCold TF載體序列中限制性酶切位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)位于HisTag序列前端的NheⅠ和后端的BubⅠ是載體中單一的酶切位點(diǎn)，且載體不含酶切位點(diǎn)SpeⅠ.通過設(shè)計(jì)特定的PCR引物，并運(yùn)用PCR、限制性酶切、連接等分子生物學(xué)方法，成功去除pCold TF載體中的HisTag序列，并且不影響原載體的蛋白表達(dá)能力，將此新質(zhì)粒命名為pL118.pL118繼承了原載體高效蛋白可溶性表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，并使之有利于去除融合蛋白中的TF助溶蛋白，將HisTag保留在目的蛋白上.在應(yīng)用pL118表達(dá)融合蛋白時(shí)要特別注意的是：在目的基因3′端引物引入HisTag序列時(shí)，將HigTag序列放置在目的基因的編碼序列和終止密碼子之間，如果HisTag序列放置在終止密碼子之后，融合蛋白的表達(dá)將提前終止而不含HisTag.

膜蛋白具有多種多樣的細(xì)胞功能，是基礎(chǔ)研究及藥物開發(fā)的理想靶標(biāo)，然而研究膜蛋白有一個(gè)難題，它們的過表達(dá)對(duì)宿主有毒性而限制蛋白產(chǎn)量，或產(chǎn)生包涵體增加純化難度.人CD81是一種四跨膜蛋白，將其克隆到pET28b載體中嘗試原核表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沒有可溶性目的蛋白的表達(dá)，關(guān)于CD81原核表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道也集中于CD81胞外大環(huán)可溶片段的表達(dá).CD81參與細(xì)胞的粘附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有影響細(xì)胞增殖和分化等生物學(xué)功能，是細(xì)胞表面的免疫調(diào)節(jié)分子，并作為受體介導(dǎo)HCV感染宿主細(xì)胞.近期有報(bào)道稱，CD81不僅是HCV感染中的一個(gè)受體，還可影響HCV RNA的復(fù)制［8］，或通過激活細(xì)胞的Raf/MEK/ERK信號(hào)通路而影響HCV在宿主細(xì)胞中的生活周期［9］，在慢性丙型肝炎病人的血清中，可溶性的CD81蛋白水平升高，并參與病人肝纖維化的形成［10］，因此對(duì)CD81的進(jìn)一步研究具有重要的理論與實(shí)踐意義.

4 結(jié)語

本文將CD81克隆到pL118載體中，實(shí)現(xiàn)了CD81融合蛋白高效可溶性表達(dá)，使用NiNTA親和層析柱對(duì)融合蛋白純化，再利用Factor Xa蛋白酶去除TF助溶蛋白，成功獲得含有HisTag的全長(zhǎng)CD81蛋白.人膜蛋白CD81的表達(dá)純化證實(shí)了pL118載體使表達(dá)困難的基因獲得更高概率的可溶性表達(dá)，為CD81靶向藥物篩選、抗體制備及深入研究CD81與HCV之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ).pL118載體的構(gòu)建以及CD81蛋白的表達(dá)純化方法具有一定的創(chuàng)新性，為表達(dá)困難的基因?qū)崿F(xiàn)原核表達(dá)提供了一種新的思路和方法.

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