乙酰左旋肉堿對(duì)大鼠脊髓損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

張夢(mèng)潔 郭垚輝 任 彬 魏雅馨 崔 佳 沈 娟 楊彥玲 劉敏麗

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的致殘性疾病，由于外力直接或間接作用于脊髓引起其結(jié)構(gòu)與功能損害，造成損傷平面以下脊髓神經(jīng)功能障礙。在原發(fā)損傷的基礎(chǔ)上，又會(huì)出現(xiàn)一系列復(fù)雜的病理生理變化，包括局部缺血缺氧、水腫、炎癥反應(yīng)、電解質(zhì)改變、自由基產(chǎn)生、谷氨酸和天門冬氨酸等興奮性氨基酸的釋放及脂質(zhì)過氧化等一系列病理過程[1-2]。乙酰左旋肉堿(acetyl-L-carnitine，ALC)是存在于體內(nèi)的一種左旋肉堿的酯化產(chǎn)物，可穿過血腦屏障[3]。研究表明ALC可提高組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二酸(MDA)含量，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力[4-6]，在脊髓損傷后乙酰左旋肉堿治療可以改善線粒體功能，與顯著的組織保留和功能恢復(fù)相關(guān)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究 ALC 對(duì)急性脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響和神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、線粒體形態(tài)恢復(fù)的影響，為深入研究脊髓損傷后乙酰左旋肉堿對(duì)損傷脊髓的保護(hù)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要儀器試劑SPF級(jí)SD大鼠72只，體質(zhì)量(160±180 g)，雌性。購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SCXK(陜)2017-003。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于每天12 h∶12 h(光照∶避光)、安靜、清潔、溫度(20～22 ℃)、濕度45%～55%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，自由攝入食物、水。所有實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。ALC(Sigma-Aldrich)、HI-0400脊髓打擊器(美國(guó)PSI公司)、石蠟切片機(jī)2245(湖北徠克醫(yī)療)。多聚甲醛：天津化學(xué)試劑廠。蘇木素伊紅染液：溫州康泰生物科技有限公司。

1．2改良Allen’s法大鼠SCI模型制備大鼠術(shù)前6 h禁食、水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉。以T10 棘突為中心作常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。沿脊柱方向作一2 cm 切口，逐層切開、分離組織，微型鉗咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜。固定大鼠于 HI-0400 脊髓打擊器上，充分暴露脊髓 T10節(jié)段。打擊力度 200 kdyn/cm2，致傷后大鼠隨即出現(xiàn)雙下肢、軀體撲動(dòng)、強(qiáng)直，鼠尾擺動(dòng)樣表現(xiàn)，脊髓打擊處迅速充血水腫。傷口逐層縫合，嚴(yán)格無菌操作。大鼠清醒后出現(xiàn)雙后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙，視為造模成功。

1．3大鼠分組給藥及術(shù)后護(hù)理大鼠隨機(jī)分為3組：脊髓損傷組(SCI 組) 、乙酰左旋肉堿組(SCI+ALC 組)、假手術(shù)組(Sham 組)，每組22只。

Sham組大鼠不打擊脊髓，只進(jìn)行椎板去除術(shù)，然后逐層縫合切口。ALC組在脊髓損傷模型建立后30 min腹腔注射給藥乙酰左旋肉堿200 mg/kg，之后每天同一時(shí)間點(diǎn)給藥1次，持續(xù)7 d。7 d 后每周給藥1 次；持續(xù)至第 5 周；Sham組和SCI組相同時(shí)間點(diǎn)、相同體積生理鹽水對(duì)照。大鼠術(shù)后單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在18～22 ℃，保持飼養(yǎng)籠內(nèi)清潔、干燥，飲食不限量。術(shù)后連續(xù)3 d皮下注射50 000 U/支青霉素，1次/d。手術(shù)傷口消毒；擠壓膀胱輔助排尿早中晚3次，直至膀胱功能恢復(fù)。過程中動(dòng)物缺失立即相同條件下予以補(bǔ)齊。

1．4大鼠后肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分及行為學(xué)觀察術(shù)前2 d起分別由2名獨(dú)立觀察者(熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但非本組的實(shí)驗(yàn)人員)采用雙盲法，將動(dòng)物分別放置于直徑為2 m的圓形平臺(tái)上觀察4 min，記錄其后肢運(yùn)動(dòng)情況，采用BBB評(píng)分法[9]。并分別于術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d對(duì)雙后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，每只大鼠的后肢體運(yùn)動(dòng)功能得分取2人評(píng)分平均值。

1．5灌流及取材分別于各組大鼠術(shù)后1、3 d，每組取3只，常規(guī)麻醉。大鼠取仰臥位，開胸后右心耳采血3 mL，3 000 r/min離心10 min后取血清置于 -20 ℃冰箱內(nèi)保存。左心尖插入灌注針向上伸至升主動(dòng)脈，動(dòng)脈夾固定。4 ℃無菌生理鹽水快速灌注至肝臟發(fā)白及右心耳流出液無色透明液體后，用4%多聚甲醛灌注至大鼠軀體僵硬。置于冰上解剖脊椎，以打擊脊髓處為中點(diǎn)上下各取1.5 cm脊髓組織后進(jìn)行外固定。乙醇梯度脫水后石蠟包埋，做5 μm厚切片，用于組織切片染色，蘇木素-伊紅染色后觀察病理組織變化情況。

1．6透射電鏡觀察每組分別取3只大鼠于術(shù)后24 h心臟灌流取大鼠打擊部分脊髓組織，包埋切片染色，用日本生產(chǎn)JEM1200型透射電鏡觀察。

每組分別取3只大鼠于脊髓損傷術(shù)后24 h，斷頭急性處死，冰上操作取脊髓組織修成1 mm×1 mm長(zhǎng)條形，立即投于4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液。后續(xù)經(jīng)過脫水、滲透、包埋聚合、切片、染色，透色電鏡觀察。

2 結(jié)果

術(shù)后護(hù)理過程中死亡4只，其中SCI組3只，藥物組1只，在與之前造模相同條件下予以補(bǔ)充。

2．1BBB評(píng)分結(jié)果損傷前各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常。損傷后1～3 d，SCI組和SCI+ALC組后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)無明顯區(qū)別。與Sham組相比，脊髓損傷組與乙酰左旋肉堿組大鼠后肢BBB評(píng)分明顯降低(P<0.05)。損傷后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d乙酰左旋肉堿組評(píng)分均高于SCI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。與Sham組相比，脊髓損傷組大鼠后肢BBB評(píng)分明顯降低(P<0.05)；乙酰左旋肉堿組大鼠術(shù)后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d BBB評(píng)分均高于脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．2HE染色結(jié)果脊髓損傷后，打擊處出現(xiàn)空洞，神經(jīng)元壞死，神經(jīng)纖維脫髓鞘，急性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。光鏡下觀察染色切片，Sham組第1天、第3天脊髓灰白質(zhì)交界清楚，無出血及水腫灶，神經(jīng)元豐富，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰可見，無核固縮及壞死現(xiàn)象(圖2A、D)。SCI組損傷后1 d，神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體模糊，空洞周圍神經(jīng)元水腫變性，出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B)。SCI組損傷后3 d，神經(jīng)元死亡，有小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞(圖2E)。SCI+ALC組損傷后1 d，空洞周圍神經(jīng)元變性明顯(圖2C)。損傷后3 d，變性的神經(jīng)元有好轉(zhuǎn)，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸清楚(圖2F)。

2．3透射電鏡觀察結(jié)果手術(shù)后24 h電鏡下觀察，Sham組線粒體線粒體呈橢圓形，嵴與長(zhǎng)軸平行或垂直，排列清楚。SCI組線粒體腫脹，呈橢圓形、不規(guī)則形或呈啞鈴狀，線粒體嵴碎裂，有空泡化，含量較少。

SCI+ALC組神經(jīng)元細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚，核膜完整。胞漿內(nèi)線粒體含量較多且結(jié)構(gòu)完整，線粒體空泡化也較損傷組減輕。見圖3。

圖1 各組大鼠35 d的BBB評(píng)分變化 與SCI組相比，*P<0.05Figure 1 Changes in BBB scores of rats in each group at 35 days compared with SCI group，*P<0.05

表1 大鼠SCI后BBB評(píng)分 (分，

A：Sham組第1天；B：SCI組術(shù)后第1天；C：SCI+ALC組術(shù)后第1天；D：Sham組第3天；E：SCI組術(shù)后第3天；F：SCI+ALC組術(shù)后第3天圖2 術(shù)后1～3天各組脊髓組織的HE染色(光鏡10×40倍)Figure 2 HE staining of spinal cord tissues in each group 1-3 days after surgery(10×40 times)

圖3 脊髓損傷后各組線粒體形態(tài)學(xué)觀察(電鏡×8 000) A：Sham組；B：SCI組；C：SCI+ALC組Figure 3 EM showing mitochondrial morphology after SCI(×8 000)．A：Sham group；B：SCI group；C：SCI+ALC group

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，脊髓損傷發(fā)生率呈逐年增高的趨勢(shì)[10]。創(chuàng)傷性脊髓損傷(SCI)對(duì)患者及其家屬的身體、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)心理健康均具有破壞性的影響。由于SCI獨(dú)特的病理生理學(xué)特征，即最初的創(chuàng)傷性損傷(原發(fā)損傷)之后是繼發(fā)的進(jìn)行性損傷級(jí)聯(lián)，其特征是缺血、促凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[11-12]。

隨著促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性碎片(DNA、ATP、活性氧)的釋放循環(huán)增加了損傷后的微環(huán)境[13]。病變發(fā)展到慢性期，周圍的星形膠質(zhì)纖維瘢痕的形成嚴(yán)重阻礙了神經(jīng)組織的再生[14]。因此在脊髓損傷后早期，探究可能的干預(yù)措施對(duì)長(zhǎng)期的功能恢復(fù)產(chǎn)生較大的影響。

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)一種高效的細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)功能的正常是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化、生成三磷酸腺苷的物質(zhì)保障[15]。乙酰左旋肉堿(ALC)是左旋肉堿(L-Carnitine，LC)的主要乙酰酯，作為乙?；墓w，在β-氧化過程中促進(jìn)脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體[16-17]。同時(shí)，ALC還具有抗氧化和抗凋亡作用，且對(duì)線粒體代謝有積極的作用[18]。急性脊髓損傷后，線粒體通過多種途徑參與神經(jīng)損傷，其中，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和脊髓功能障礙的重要原因之一，如果能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)將有效促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。線粒體形態(tài)學(xué)的改變提示急性脊髓損傷后的線粒體功能的變化，MEYER等[19]發(fā)現(xiàn)線粒體在急性脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷中起重要作用。另有研究表明[20]，SCI后線粒體形態(tài)不規(guī)則，體積增大。線粒體嵴紊亂，損傷后2～24 h可見線粒體膜破裂。在繼發(fā)性損傷中，線粒體功能的喪失會(huì)引起細(xì)胞死亡級(jí)聯(lián)[21-23]，且有缺陷的線粒體不僅導(dǎo)致生物能量效率低下的細(xì)胞，而且還增加了ROS的生成，從而進(jìn)一步導(dǎo)致組織氧化應(yīng)激。而ALC能促進(jìn)谷胱甘肽的生成從而促進(jìn)活性氧清除酶的生成，保護(hù)線粒體酶免受氧化損傷。在氧化磷酸化過程中，ALC與長(zhǎng)鏈脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的運(yùn)輸密切相關(guān)。因此線粒體在維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞器之間的聯(lián)系、氧自由基的生成以及介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用[23-24]。

本實(shí)驗(yàn)在急性脊髓損傷后應(yīng)用ALC，通過行為學(xué)縱橫時(shí)間點(diǎn)的觀察發(fā)現(xiàn)，損傷發(fā)生后，大鼠后肢癱瘓，運(yùn)動(dòng)功能喪失。隨著損傷后時(shí)間的延長(zhǎng)，后肢的運(yùn)動(dòng)功能逐漸恢復(fù)。相同時(shí)間點(diǎn)不同組別的比較發(fā)現(xiàn)，乙酰左旋肉堿可以提高急性脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。這種療效可能與乙酰左旋肉堿減輕了神經(jīng)細(xì)胞和組織的損傷，促進(jìn)了神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的組織學(xué)基礎(chǔ)相關(guān)。ALC作用后觀察脊髓損傷部位的形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)變性水腫的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)逐漸清楚，細(xì)胞核清晰可見。進(jìn)一步探究神經(jīng)元胞體中線粒體結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，損傷后24 h SCI組線粒體腫脹，呈橢圓形、不規(guī)則形或呈啞鈴狀，線粒體嵴碎裂，有空泡化，數(shù)目減少。應(yīng)用ALC的治療組，線粒體空泡化也較損傷組減輕，線粒體結(jié)構(gòu)開始趨向完整。說明乙酰左旋肉堿能夠減輕SCI后的繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[25-26]。ALC通過對(duì)SCI后對(duì)線粒體的保護(hù)從而減輕繼發(fā)性損傷給機(jī)體帶來的危害，其機(jī)制可能與通過維持損傷后的線粒體穩(wěn)態(tài)抑制神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)了脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)有關(guān)。為進(jìn)一步研究ALC對(duì)線粒體的保護(hù)機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

志謝本研究及學(xué)術(shù)論文是在我的導(dǎo)師劉敏麗副教授的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)下完成