百合多糖提取及成分分析

張國(guó)強(qiáng) 楊正平

摘要：采用水提醇沉法提取百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）中的多糖成分，Ｓｅｖａｇｅ法除蛋白質(zhì)，凝膠色譜法進(jìn)行多糖純化，制備３－甲基－１－苯基－２－吡唑啉酮（ＰＭＰ）衍生物進(jìn)行高效液相色譜分析。結(jié)果表明，百合多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖５種單糖組成，其含量分別為４．８２％、１２．７９％、４７．０２％、１３．０１％、２２．３６％。

關(guān)鍵詞：百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）；多糖；提取；成分分析

中圖分類號(hào)：Ｒ２８４．２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3298-02

Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ

ＺＨＡＮＧ Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ，ＹＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｐｉｎｇ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ， Ａｎｙａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｎｙａｎｇ ４５５０００，Henan，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ－ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｓｅｖａｇｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ｏｆ ｔｈｅ ＰＭＰ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ Ｂ. ｌｉｌｉｉ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｒｈａｍｎｏｓｅ， ａｒａｂｉｎｏｓｅ， ｇｌｕｃｏｓｅ， ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｇａｌａｃｔｏｓｅ， ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ４．８２％， １２．７９％， ４７．０２％， １３．０１％ ａｎｄ ２２．３６％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； extraction； ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ

百合（Ｂｕｌｂｕｓ ｌｉｌｉｉ）是百合科百合屬多年生草本球根植物［１］，其味甘、微苦，具有補(bǔ)益心肺、調(diào)理脾胃、清熱止痰之功效，對(duì)體虛肺弱、慢性支氣管炎、肺氣腫、肺結(jié)核及神經(jīng)衰弱、失眠、高血壓、胃潰瘍等有一定療效［２］，是傳統(tǒng)的藥食同源植物。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)百合多糖具有較為廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗腫瘤、降血糖與免疫調(diào)節(jié)等［３－５］。本研究對(duì)百合多糖的提取工藝及主要成分進(jìn)行初步分析，以期為百合的綜合利用提供一定的理論參考。

１材料與方法

１．１材料與儀器

百合購(gòu)于河南省安陽(yáng)市藥材批發(fā)市場(chǎng)；乙醇、丙酮、三氟乙酸、３－甲基－１－苯基－２－吡唑啉酮（ＰＭＰ）、氫氧化鈉、無(wú)水醋酸酐、氯仿等試劑為分析純；標(biāo)準(zhǔn)單糖鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖為色譜純。

儀器包括安捷倫１２６０高效液相色譜儀（配有紫外及蒸發(fā)光檢測(cè)器，Ｃ１８柱）、電子分析天平、ＡＬＰＨＡＬ－２真空冷凍干燥機(jī)、真空干燥箱、ＲＥ５２－３旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、ＴＤＺ５－ＷＳ低速離心機(jī)、電子恒溫水浴鍋、ＣＳ１０１－ＩＣ型干燥箱、ＢＡＺ－１００自動(dòng)分步收集器、ＤＨＬ－Ａ電腦恒流泵等。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１百合多糖的提?、侔俸隙嗵谴制返闹苽洹７Q百合樣品５．０００ ｇ，粉碎后加入１０倍體積的蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液ｐＨ至１１，沸水浴提?。?ｈ，重復(fù)４次，過(guò)濾合并濾液，于６０ ℃真空濃縮至約５０ ｍＬ，以體積分?jǐn)?shù)９５％的乙醇溶液沉淀，過(guò)濾，濾渣加５倍體積的丙酮—石油醚混合液（體積比１∶１），于６０ ℃水浴浸提１ ｈ，過(guò)濾，得沉淀，６０ ℃真空干燥１ ｈ，再于１０５ ℃干燥箱中烘干，即得灰白色的百合多糖粗品。②脫蛋白多糖的制備。取多糖粗品，加蒸餾水充分溶解，用Ｓｅｖａｇｅ法脫蛋白，離心，取上清液對(duì)流水透析４８ ｈ，再對(duì)蒸餾水透析２４ ｈ，無(wú)水乙醇沉淀，抽濾得沉淀，真空冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。③多糖精品的制備。取適量脫蛋白的多糖，加蒸餾水充分溶解，上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５凝膠色譜柱，用蒸餾水洗脫，４．５ ｍＬ／管自動(dòng)分步收集，苯酚—硫酸法檢測(cè)，合并主峰收集管液，６０ ℃真空濃縮，冷凍干燥得精制的百合多糖。

１．２．２多糖成分的分析①多糖水解。稱?。保?ｍｇ精制的百合多糖樣品于安瓿瓶中，加入２ ｍＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ的三氟乙酸［６］，封管后置于１２０ ℃干燥箱中水解，２ ｈ后取出冷卻，離心后取上清液，真空濃縮至干，得單糖樣品置于干燥箱中備用。②單糖的衍生化。稱取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品各１０ ｍｇ，分別加入單糖２倍物質(zhì)的量的ＰＭＰ，調(diào)ｐＨ至１１，充分振蕩溶解，于６０ ℃水浴反應(yīng)３０ ｍｉｎ，取出冷卻到室溫，真空濃縮蒸干，用于液相色譜分析。多糖水解后所得單糖樣品的衍生化操作方法相同。③液相色譜分析條件。Ｃ１８色譜柱，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)２５０ ｎｍ，柱溫為室溫，進(jìn)樣量２０ μＬ，流動(dòng)相溶劑Ａ：１５％乙腈＋２０ ｍｏｌ／Ｌ乙酸銨水溶液，溶劑Ｂ：４０％乙腈＋２０ ｍｏｌ／Ｌ乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序?yàn)樵冢埃保保?ｍｉｎ內(nèi)溶劑Ｂ的體積分?jǐn)?shù)從０線性增加到１００％，流速１．２ ｍＬ／ｍｉｎ。

２結(jié)果與分析

將提取所得的百合多糖進(jìn)樣記錄色譜圖，參照單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖確定主要的指紋峰；采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件（２００４Ａ），將全譜導(dǎo)入后，經(jīng)譜圖處理，以軟件自動(dòng)生成的對(duì)照?qǐng)D譜為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正將譜峰進(jìn)行比較，得到相似度結(jié)果，查看樣品的相關(guān)性。

根據(jù)各色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)照，可知百合多糖水解物液相色譜圖中各峰代表的單糖分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖（圖１），采用面積歸一化方法計(jì)算單糖的含量，結(jié)果見表１。

３討論

ＰＭＰ與糖類物質(zhì)衍生時(shí)反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物無(wú)立體異構(gòu)。２分子ＰＭＰ與１分子單糖縮合生成的衍生物與各單糖的定量關(guān)系明確，線性關(guān)系良好。檢測(cè)靈敏度較高，可同時(shí)檢測(cè)醛糖、酮糖及糖醛酸；ＰＭＰ衍生物在２５４ ｎｍ處有強(qiáng)烈的紫外吸收，克服了單糖本身沒(méi)有紫外吸收峰的缺點(diǎn)，同時(shí)使用紫外檢測(cè)器克服了示差檢測(cè)器靈敏度低、不適用于梯度洗脫的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)中采用ＰＭＰ衍生物液相色譜法進(jìn)行百合多糖組成分析，其衍生物制備簡(jiǎn)便、試劑易得，且每種單糖均可得到單一色譜峰。分析結(jié)果表明百合多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、半乳糖５種單糖組成，其含量分別為４．８２％、１２．７９％、４７．０２％、１３．０１％、２２．３６％。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 田愛梅，鄭日如，王國(guó)強(qiáng)，等． 中國(guó)野生百合種質(zhì)資源的研究、保護(hù)與利用［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７，３５（３１）：９９８７－９９９０．

［２］ 王燕． 我國(guó)百合產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及其發(fā)展對(duì)策［Ｊ］．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００７（５）：１５０－１５２，１５６．

［３］ 趙國(guó)華，李志孝，陳宗道．百合多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性［Ｊ］． 食品與生物技術(shù)，２００２，２１（１）：６２－６６．

［４］ 劉成梅，付桂明，涂宗才，等． 百合多糖降血糖功能研究［Ｊ］．食品科學(xué)，２００２，２３（６）：１１３－１１４．

［５］ 姜茹，匡永清，吳少華．百合免疫活性多糖的分離及其組成［Ｊ］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，１９９８，１９（２）：１８８．

［６］ 張惟杰．復(fù)合多糖生化研究技術(shù)［Ｍ］． 杭州：浙江大學(xué)出版社，１９９９．３８－４０．