• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      對(duì)二氯苯對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

      2012-04-29 11:37:33徐文品丁成楊春生朱光燦楊唐儀
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年18期
      關(guān)鍵詞:多樣性

      徐文品 丁成 楊春生 朱光燦 楊唐儀

      摘要:利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)考查了對(duì)二氯苯脅迫對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。通過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間(4、18和45 d)和不同培養(yǎng)濃度(120、240、360和600 mg/kg)對(duì)二氯苯污染下濕地土壤細(xì)菌群落基因組的變性梯度凝膠電泳(DGGE)多樣性分析。結(jié)果表明,各處理下的土壤細(xì)菌群落多樣性在不同處理時(shí)間有明顯差異。培養(yǎng)初期對(duì)二氯苯對(duì)土壤細(xì)菌群落抑制作用非常顯著,土壤細(xì)菌中某些群落的生長(zhǎng)受到抑制;不同處理在處理后期差異很小。在土壤培養(yǎng)初期,含對(duì)二氯苯240 mg/kg的培養(yǎng)基上出現(xiàn)一條新增條帶,為對(duì)照和低濃度對(duì)二氯苯土壤所沒(méi)有,說(shuō)明土壤中存在對(duì)二氯苯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌。

      關(guān)鍵詞:變性梯度凝膠電泳(DGGE);對(duì)二氯苯;濕地土壤細(xì)菌菌群;多樣性

      中圖分類號(hào):Q935文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)18-4134-04

      Effect of 1,4-Dichlorobenzene on Diversity of Bacteria Communities in Wetland Soil

      XU Wen-pin1,2,DING Cheng1,2,YANG Chun-sheng1,2,ZHU Guang-can3,YANG Tang-yi1,2

      (1.School of Environment, Jiangsu University, Zhenjiang 212013,Jiangsu,China;

      2.College of Chemical and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology,Yancheng 224051,Jiangsu,China;

      3.Yancheng Environment Test Center, Yancheng 224051, Jiangsu,China)

      Abstract: The effect of different concentration of 1,4-dichlorobenzene(120,240,360 and 600 mg/kg) with different cultivation time (4, 18 and 45 d) on wetland bacterial community diversity was studied using PCR-DGGE technique. The results showed that the effect of each concentration of 1,4-dichlorobenzene on genetic diversity of soil bacteria differed at different treating time. In early treatment period, soil bacterial community was inhibited obviously. The difference among different treatments in later period was little. In early treatment period, a new medium band emerged in the culture medium of 240 mg/kg of 1,4-dichlorobenzene treatment, indicating that there were special microbial species resistant to 1,4-dichlorobenzene existed in the soil.

      Key words: DGGE; 1,4-dichlorobenzene; wetland soil bacteria communities; diversity

      土壤微生物在土壤生態(tài)中扮演了重要角色[1],并且參與地球生物生態(tài)系統(tǒng)的化學(xué)循環(huán),進(jìn)行污染物質(zhì)的降解[2,3]。但是由于土壤微生物個(gè)體微小、數(shù)量眾多、土壤環(huán)境條件復(fù)雜等原因,用常規(guī)的分離培養(yǎng)法很難全面有效地評(píng)估土壤中微生物群體多樣性及環(huán)境污染對(duì)土壤微生物的影響,極大地限制了人們對(duì)土壤微生物的認(rèn)識(shí)[4]。伴隨分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的不斷應(yīng)用,不經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng),直接從土壤中抽取出土壤微生物總DNA,利用微生物遺傳多樣性及區(qū)系基因變化來(lái)進(jìn)行污染物環(huán)境效應(yīng)的評(píng)價(jià),正在被廣泛采用[5-7]。

      研究排除其他因素,通過(guò)提取濕地土壤細(xì)菌群落總DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳(DGGE),獲得土壤細(xì)菌群落16S rDNA V3序列分布,以此研究對(duì)二氯苯對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。旨在為更直接更可靠地反映對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤細(xì)菌群落的組成情況,評(píng)估污染條件下土壤微生物的多樣性。

      1材料與方法

      1.1供試土壤

      供試土壤取自鹽城海濱濕地土壤,無(wú)人為污染。收集10~20 cm處新鮮土壤,室內(nèi)陰干,研磨,充分混勻,過(guò)40目篩。

      1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      試驗(yàn)選擇20 cm × 40 cm的塑料桶,桶內(nèi)加入2 kg土壤,加入適量去離子水,使水面浸過(guò)土壤1~2 cm。桶內(nèi)加入配制好的對(duì)二氯苯母液,使桶內(nèi)對(duì)二氯苯濃度分別為0、120、240、360和600 mg/kg,每組3次重復(fù),室溫20 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中不斷補(bǔ)水,保證水位高于土壤1~2 cm。分別在第四天、第18天和第45天時(shí),從桶內(nèi)0~10 cm深度處取土樣10 g,采集后的土壤樣品-20 ℃保存。

      1.3土壤中細(xì)菌群落DNA的提取

      2 g土壤樣品加0.25 g直徑0.1 mm 玻璃珠,再加2 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液,混勻5 min,室溫3 000 r/min離心2 min;提上清液,室溫12 000 r/min離心15 min,棄上清液,加入370 μL消化液(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L磷酸鈉,1.5 mol/L NaCl,1% CTAB,pH 8.0),30 μL 10% SDS,10 μL溶菌酶 ,46 ℃水?。?h,加10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)水?。?h;加500 μL氯仿、苯酚混合物,混勻10 min,室溫12 000 r/min離心,留上清液,加等體積氯仿-異戊醇 (24∶1,V/V) 混勻10 min;室溫8 000 r/min離心 5 min,留上清液,加醋酸鈉 30 μL 12 000 r/min離心15 min,加1 mL 70% 乙醇,室溫10 000 r/min離心 5 min;棄上清液,倒置風(fēng)干,加50 μL pH 8.0 TE緩沖液。取一定量樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)土壤細(xì)菌群落總DNA 的提取質(zhì)量[8]。

      1.4PCR擴(kuò)增

      擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×PCR緩沖液5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 4 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各1.5 μL,模板DNA 1 μL,Taq酶 (10 000 U/mL) 0.5 μL,加去離子水至50 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在Eppendorf AG公司的22331型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后?。?μL反應(yīng)液在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。用于16S rDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列為:338F(CCTACGGGAGGCAGCAG)和518R(ATTACCGCGGCTGCTGG)。

      1.5變性梯度凝膠電泳和染色

      PCR產(chǎn)物加入到8%(m/V)聚丙烯酰胺凝膠中,凝膠的變性范圍為40%~60%。利用DGGE-1B型電泳系統(tǒng),在60 ℃、150 V、1×TAE Buffer下電泳330 min。電泳結(jié)束后,用固定液(10%冰醋酸)固定凝膠20 min,用去離子洗滌凝膠3次,每次2 min,取出凝膠板豎起控水15 s,將洗后的凝膠浸泡在染色液(含0.15%硝酸銀和150 μL甲醛的混合液)中20 min,然后取出凝膠,在去離子水中浸洗10 s,立即浸泡在顯影液(含2.5%無(wú)水碳酸鈉和25 μL甲醛的混合液)中,緩慢地?fù)u晃至條帶完全顯現(xiàn)。將凝膠置于中止液(0.5 mol/L EDTA-Na2)中浸泡10 min,再用去離子水浸洗凝膠3次,取出凝膠豎起控水[9]。

      1.6指紋圖譜生物信息學(xué)分析

      采用Ward法計(jì)算各樣品間的相似指數(shù),DGGE指紋圖譜分析借助于Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶判讀,以配套軟件Quantity One進(jìn)行遷移率、強(qiáng)度、面積計(jì)算,并計(jì)算樣品間的相似指數(shù)、繪制泳道間遺傳圖。

      2結(jié)果與分析

      2.1對(duì)二氯苯處理4 d后濕地土壤細(xì)菌群落總DNA的DGGE分析

      圖1為不同濃度對(duì)二氯苯處理土壤4 d后土壤細(xì)菌群落DGGE分析結(jié)果。由圖1可知,試驗(yàn)初期,不同濃度對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤細(xì)菌群落的基因條帶出現(xiàn)較明顯的差別。與對(duì)照相比,低濃度對(duì)二氯苯脅迫下條帶變化不大,但其中條帶a、b亮度變暗消失,條帶c、d亮度增加。表明濕地土壤中大多數(shù)細(xì)菌群落對(duì)低濃度對(duì)二氯苯有一定的耐受性,基本不受影響,甚至對(duì)某類微生物具有一定的刺激作用,產(chǎn)生新條帶,如條帶e。而360 mg/kg時(shí),某些微生物對(duì)較高對(duì)二氯苯脅迫較為敏感,數(shù)量大大降低,達(dá)到DGGE分辨率下限。電泳圖譜泳道間的遺傳簇關(guān)系(圖2)同樣印證了上述結(jié)果,在圖2中,對(duì)二氯苯濃度為120 mg/kg時(shí)與對(duì)照最為接近,第3、第4和第5泳道則與對(duì)照的相似性為57.8%~75.0%,較處理初期時(shí)明顯降低。隨著土壤中對(duì)二氯苯濃度的增加,土壤中細(xì)菌群落基因多樣性受到的影響也逐漸增強(qiáng),到土壤對(duì)二氯苯濃度為240 mg/kg時(shí),整個(gè)泳道條帶出現(xiàn)明顯差別。值得注意的是,在土壤處理4 d時(shí),240 mg/kg對(duì)二氯苯濃度下,出現(xiàn)一條新增條帶,而對(duì)照及其他濃度下土壤都沒(méi)有,說(shuō)明土壤中可能有在對(duì)二氯苯較高濃度下良好生長(zhǎng)的微生物種。

      2.2對(duì)二氯苯處理18 d土壤細(xì)菌群落總DNA的DGGE分析

      圖3為不同濃度對(duì)二氯苯處理18 d土壤中細(xì)菌群落DGGE分析結(jié)果。由圖3可知,在處理18 d時(shí),與對(duì)照相比,120 mg/kg對(duì)二氯苯脅迫與對(duì)照土壤的細(xì)菌群落有77.4%的相似性,再次說(shuō)明濕地土壤中大多數(shù)細(xì)菌對(duì)對(duì)二氯苯有耐受性,另一些細(xì)菌則受到了抑制,表現(xiàn)出條帶亮度變暗,如圖3中的條帶a、b。第3和第4泳道上出現(xiàn)的條帶c則表明在240 mg/kg和360 mg/kg濃度下有適應(yīng)該濃度的細(xì)菌,在240 mg/kg濃度處理4 d時(shí)出現(xiàn)的新條帶反映的可能是此種細(xì)菌,隨著土壤中對(duì)二氯苯的揮發(fā),原來(lái)360 mg/kg濃度降低至該種細(xì)菌能適應(yīng)的濃度。由處理18 d時(shí)電泳圖譜泳道間的遺傳簇關(guān)系(圖4)可見(jiàn),第2、第3和第4泳道與對(duì)照的相似性為73.4%~76.5%,較處理初期相比有所提升,而對(duì)二氯苯含量600 mg/kg的相似性也從處理初期的62.7%提高到了69.4%。造成這種情況的原因可能是隨著對(duì)二氯苯的在土壤中的降解以及揮發(fā),在土壤中的有效濃度降低,微生物的生長(zhǎng)受到的抑制作用減小所引起的。值得注意的是,在土壤處理18 d時(shí),原來(lái)在240 mg/kg濃度時(shí)出現(xiàn)的新條帶也在360 mg/kg時(shí)出現(xiàn)了,而對(duì)照及其他處理都沒(méi)有,更加肯定了此種微生物能適應(yīng)土壤中適宜的對(duì)二氯苯濃度。

      2.3對(duì)二氯苯處理45 d土壤細(xì)菌群落總DNA的DGGE分析

      對(duì)二氯苯處理45 d時(shí)土壤細(xì)菌群落DGGE電泳圖譜與處理4 d時(shí)相比發(fā)生了較大的改變,各濃度對(duì)二氯苯處理下條帶數(shù)目有所增加(圖5),在土壤培養(yǎng)45 d時(shí),不同處理土壤樣品之間差異開(kāi)始變小,對(duì)二氯苯濃度為120 mg/kg時(shí)譜型與對(duì)照的相似性為84.3%,但亮度稍變暗;對(duì)二氯苯濃度為360 mg/kg時(shí)譜型與對(duì)照的相似度達(dá)到71.5%。圖6中不同處理譜型與對(duì)照的相似性都在70.0%以上,其中120 mg/kg處理時(shí)更是達(dá)到84.3%。表明在土壤培養(yǎng)45 d時(shí),不同對(duì)二氯苯濃度的土壤樣品之間的差異開(kāi)始變小。

      3結(jié)論

      通過(guò)對(duì)不同處理時(shí)間、不同濃度對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤的細(xì)菌群落總DNA進(jìn)行DGGE多樣性分析,結(jié)果表明,不同濃度對(duì)二氯苯對(duì)濕地土壤細(xì)菌組成產(chǎn)生了明顯影響。不同濃度對(duì)二氯苯不僅影響了組成細(xì)菌群落的細(xì)菌種群數(shù)目,還使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性發(fā)生了改變。說(shuō)明土壤細(xì)菌群落中各個(gè)種群是相互作用的,各土壤樣品細(xì)菌群落遺傳多樣性是對(duì)各種群的群體性反映。但是細(xì)菌群落遺傳多樣性并不是簡(jiǎn)單地隨著對(duì)二氯苯濃度提高而減小。在較低濃度對(duì)二氯苯污染的樣點(diǎn),DGGE圖譜條帶數(shù)目雖然變化不大,但組成圖譜的條帶亮度不同。說(shuō)明不同種類的細(xì)菌不僅對(duì)對(duì)二氯苯的敏感性不同,而且對(duì)不同程度的對(duì)二氯苯污染敏感性也不同??紤]到細(xì)菌種群之間諸如偏利、協(xié)同、共生、偏害、競(jìng)爭(zhēng)等復(fù)雜的關(guān)系,可能是一定程度的對(duì)二氯苯污染改變了群落內(nèi)部種群之間的關(guān)系,某些對(duì)對(duì)二氯苯敏感的細(xì)菌的消亡或者一些耐受對(duì)二氯苯的細(xì)菌產(chǎn)生的抗性保護(hù)了其他種群的細(xì)菌。細(xì)菌群落的耐受性可能是因?yàn)楹筇爝m應(yīng)、基因突變或者通過(guò)群落結(jié)構(gòu)中種群組成的改變而更具有耐受性。對(duì)二氯苯污染土壤微生態(tài)環(huán)境與細(xì)菌多樣性的內(nèi)在關(guān)系主要表現(xiàn)在作用與反作用、抑制與適應(yīng)、穩(wěn)定與變異、誘導(dǎo)與重建的相互依存、相互影響、共同演化,其結(jié)果使得適應(yīng)對(duì)二氯苯脅迫環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌群得以保留,群落結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化,耐受性提高。

      在研究中,在土壤處理初期含對(duì)二氯苯240 mg/kg的培養(yǎng)土中出現(xiàn)一條新增條帶,為對(duì)照及其他處理土壤所沒(méi)有,處理后期隨著對(duì)二氯苯濃度降低而消失,說(shuō)明土壤中存在著適應(yīng)對(duì)二氯苯適宜濃度而良好生長(zhǎng)的細(xì)菌。

      參考文獻(xiàn):

      [1] ARTURSSON1 V, FINLAY R D, JANSSON J K. Interactions between arbuscular mycorrhizal fungi and bacteria and their potential for stimulating plant growth[J]. Environmental Microbiology,2006,8(1):1-10.

      [2] FIERER N, BRADFORD M A, TOWARD J R B. An ecological classification of soil bacteria[J].Ecology,2007,88:1354-1364.

      [3] 車振明.微生物學(xué)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2010.243-261.

      [4] FERRARI B C, BINNERUP S J, GILLINGS M. Microcolony cultivation on a soil substrate membrane system selects for previously uncultured soil bacteria[J]. Appl Environ Microbiol,2005,71 (12):8714-8720.

      [5] WALLIS P D, HAYNES R J, HUNTER C H, et al. Effect of land use and management on soil bacterial biodiversity as measured by PCR-DGGE[J]. Applied Soil Ecology,2010,46:147-150.

      [6] CHONG C W, TAN G Y A, WONG R C S, et al. DGGE fingerprinting of bacteria in soils from eight ecologically different sites around Casey Station,Antarctica[J]. Polar Biology,2009, 32:853-860.

      [7] 李娜,林曉珊,張毅. PCR-DGGE技術(shù)分析倒置A2/O工藝處理染織廢水中的微生物區(qū)系[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(3):490-496.

      [8] 奧斯伯F M,金斯頓R E,賽德曼J G, 等. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].第三版. 顏?zhàn)臃f,王海林,譯.北京:科學(xué)出版社,1998.

      [9] HEUER H, KRSEK M, BAKER P, et al. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel electrophoretic separation in denaturing gradients[J]. Appl Environ Microbiol,1997,63:3233-3241.

      (責(zé)任編輯鄭威)

      收稿日期:2011-10-24

      基金項(xiàng)目:江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2009171);江蘇省高?!扒嗨{(lán)工程”基金項(xiàng)目

      作者簡(jiǎn)介:徐文品(1986-),男,甘肅蘭州人,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境污染治理技術(shù),(電話)13092178089(電子信箱)xxxx12144@126.com;

      通訊作者,丁成,教授,博士,主要從事環(huán)境污染治理技術(shù)研究工作,(電話)13815588011(電子信箱)13815588011@163.com。

      猜你喜歡
      多樣性
      淺議單元導(dǎo)語(yǔ)教學(xué)策略
      試論初中體育教學(xué)方法多樣性研究
      論遵循社會(huì)規(guī)律與堅(jiān)持包容性發(fā)展的內(nèi)在邏輯
      淺談小學(xué)數(shù)學(xué)作業(yè)設(shè)計(jì)的有效性
      甘肅教育(2016年22期)2016-12-20 22:15:31
      淺析阿拉伯語(yǔ)初級(jí)階段聽(tīng)力教學(xué)材料的選擇
      利用網(wǎng)絡(luò)教學(xué)多樣性 開(kāi)展有效教學(xué)
      由古典戲曲看“代言體”在中國(guó)的前世今生
      戲劇之家(2016年22期)2016-11-30 15:13:39
      淺談新時(shí)期群文輔導(dǎo)工作的特征
      新時(shí)期群文輔導(dǎo)工作的特征
      海洋微生物次生代謝的生物合成機(jī)制
      科技資訊(2016年19期)2016-11-15 10:39:12
      化隆| 榆林市| 治县。| 泉州市| 阜南县| 临潭县| 邵阳市| 眉山市| 和平区| 邳州市| 龙门县| 叙永县| 贺兰县| 安义县| 清苑县| 富锦市| 高安市| 麻栗坡县| 山阴县| 武平县| 合山市| 遂川县| 大冶市| 会昌县| 正阳县| 苍南县| 望奎县| 清流县| 兴业县| 清丰县| 安庆市| 温泉县| 金门县| 桃园市| 白银市| 土默特左旗| 龙井市| 西藏| 呈贡县| 建湖县| 浦北县|