對(duì)二氯苯對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

徐文品 丁成 楊春生 朱光燦 楊唐儀

摘要：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－變性梯度凝膠電泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）考查了對(duì)二氯苯脅迫對(duì)濕地土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。通過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間（４、１８和４５ ｄ）和不同培養(yǎng)濃度（１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ）對(duì)二氯苯污染下濕地土壤細(xì)菌群落基因組的變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）多樣性分析。結(jié)果表明，各處理下的土壤細(xì)菌群落多樣性在不同處理時(shí)間有明顯差異。培養(yǎng)初期對(duì)二氯苯對(duì)土壤細(xì)菌群落抑制作用非常顯著，土壤細(xì)菌中某些群落的生長(zhǎng)受到抑制；不同處理在處理后期差異很小。在土壤培養(yǎng)初期，含對(duì)二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培養(yǎng)基上出現(xiàn)一條新增條帶，為對(duì)照和低濃度對(duì)二氯苯土壤所沒(méi)有，說(shuō)明土壤中存在對(duì)二氯苯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌。

關(guān)鍵詞：變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）；對(duì)二氯苯；濕地土壤細(xì)菌菌群；多樣性

中圖分類號(hào)：Ｑ９３５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－4134-04

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｗｅｔｌａｎｄ Ｓｏｉｌ

ＸＵ Ｗｅｎ－ｐｉｎ１，２，ＤＩＮＧ Ｃｈｅｎｇ1，２，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｓｈｅｎｇ１，２，ＺＨＵ Ｇｕａｎｇ－ｃａｎ３，ＹＡＮＧ Ｔａｎｇ－ｙｉ１，２

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ２１２０１３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（１２０，２４０，３６０ ａｎｄ ６００ ｍｇ／ｋｇ） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ （４， １８ ａｎｄ ４５ ｄ） ｏｎ ｗｅｔｌａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ on ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ differed ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌａｔｅｒ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ａ ｎｅｗ ｍｅｄｉｕｍ ｂａｎｄ ｅｍｅｒｇｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ２４０ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， indicating ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ resistant to 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＧＧＥ； １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ； ｗｅｔｌａｎｄ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ

土壤微生物在土壤生態(tài)中扮演了重要角色［１］，并且參與地球生物生態(tài)系統(tǒng)的化學(xué)循環(huán)，進(jìn)行污染物質(zhì)的降解［２，３］。但是由于土壤微生物個(gè)體微小、數(shù)量眾多、土壤環(huán)境條件復(fù)雜等原因，用常規(guī)的分離培養(yǎng)法很難全面有效地評(píng)估土壤中微生物群體多樣性及環(huán)境污染對(duì)土壤微生物的影響，極大地限制了人們對(duì)土壤微生物的認(rèn)識(shí)［４］。伴隨分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的不斷應(yīng)用，不經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)，直接從土壤中抽取出土壤微生物總ＤＮＡ，利用微生物遺傳多樣性及區(qū)系基因變化來(lái)進(jìn)行污染物環(huán)境效應(yīng)的評(píng)價(jià)，正在被廣泛采用［５－７］。

研究排除其他因素，通過(guò)提取濕地土壤細(xì)菌群落總ＤＮＡ，經(jīng)ＰＣＲ擴(kuò)增、變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ），獲得土壤細(xì)菌群落１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３序列分布，以此研究對(duì)二氯苯對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。旨在為更直接更可靠地反映對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤細(xì)菌群落的組成情況，評(píng)估污染條件下土壤微生物的多樣性。

１材料與方法

１．１供試土壤

供試土壤取自鹽城海濱濕地土壤，無(wú)人為污染。收集１０～２０ ｃｍ處新鮮土壤，室內(nèi)陰干，研磨，充分混勻，過(guò)４０目篩。

１．２試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇２０ ｃｍ × ４０ ｃｍ的塑料桶，桶內(nèi)加入２ ｋｇ土壤，加入適量去離子水，使水面浸過(guò)土壤１～２ ｃｍ。桶內(nèi)加入配制好的對(duì)二氯苯母液，使桶內(nèi)對(duì)二氯苯濃度分別為０、１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ，每組３次重復(fù)，室溫２０ ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中不斷補(bǔ)水，保證水位高于土壤１～２ ｃｍ。分別在第四天、第１８天和第４５天時(shí)，從桶內(nèi)０～１０ ｃｍ深度處取土樣１０ ｇ，采集后的土壤樣品－２０ ℃保存。

１．３土壤中細(xì)菌群落ＤＮＡ的提取

２ ｇ土壤樣品加０．２５ ｇ直徑０．１ ｍｍ 玻璃珠，再加２ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ８．０磷酸緩沖液，混勻５ ｍｉｎ，室溫３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２ ｍｉｎ；提上清液，室溫１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄上清液，加入３７０ μＬ消化液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鈉，１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１％ ＣＴＡＢ，ｐＨ ８．０），３０ μＬ １０％ ＳＤＳ，１０ μＬ溶菌酶 ，４６ ℃水?。?ｈ，加１０ μＬ蛋白酶Ｋ（２０ ｍｇ／ｍＬ）水?。?ｈ；加５００ μＬ氯仿、苯酚混合物，混勻１０ ｍｉｎ，室溫１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心，留上清液，加等體積氯仿－異戊醇 （２４∶１，Ｖ／Ｖ） 混勻１０ ｍｉｎ；室溫８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ，留上清液，加醋酸鈉 ３０ μＬ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ７０％ 乙醇，室溫１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ；棄上清液，倒置風(fēng)干，加５０ μＬ ｐＨ ８．０ ＴＥ緩沖液。取一定量樣品進(jìn)行１％的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)土壤細(xì)菌群落總ＤＮＡ 的提取質(zhì)量［８］。

１．４ＰＣＲ擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)體系：１０×ＰＣＲ緩沖液５ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ） ４ μＬ，ｄＮＴＰ ２ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ，模板ＤＮＡ １ μＬ，Ｔａｑ酶 （１０ ０００ Ｕ／ｍＬ） ０．５ μＬ，加去離子水至50 μＬ。反應(yīng)條件為：９５ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５４ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，共進(jìn)行３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１0 ｍｉｎ。ＰＣＲ反應(yīng)在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ公司的２２３３１型ＰＣＲ儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后?。?μＬ反應(yīng)液在１％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。用于１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列為：３３８Ｆ（ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ）和５１８Ｒ（ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ）。

１．５變性梯度凝膠電泳和染色

ＰＣＲ產(chǎn)物加入到８％（ｍ／Ｖ）聚丙烯酰胺凝膠中，凝膠的變性范圍為４０％～６０％。利用ＤＧＧＥ－１Ｂ型電泳系統(tǒng)，在６０ ℃、１５０ Ｖ、１×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ下電泳３３０ ｍｉｎ。電泳結(jié)束后，用固定液（１０％冰醋酸）固定凝膠２０ ｍｉｎ，用去離子洗滌凝膠3次，每次２ ｍｉｎ，取出凝膠板豎起控水１５ ｓ，將洗后的凝膠浸泡在染色液（含０．１５％硝酸銀和１５０ μＬ甲醛的混合液）中２０ ｍｉｎ，然后取出凝膠，在去離子水中浸洗１０ ｓ，立即浸泡在顯影液（含２．５％無(wú)水碳酸鈉和２５ μＬ甲醛的混合液）中，緩慢地?fù)u晃至條帶完全顯現(xiàn)。將凝膠置于中止液（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－Ｎａ２）中浸泡１０ ｍｉｎ，再用去離子水浸洗凝膠３次，取出凝膠豎起控水［９］。

１．６指紋圖譜生物信息學(xué)分析

采用Ｗａｒｄ法計(jì)算各樣品間的相似指數(shù)，ＤＧＧＥ指紋圖譜分析借助于Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶判讀，以配套軟件Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ進(jìn)行遷移率、強(qiáng)度、面積計(jì)算，并計(jì)算樣品間的相似指數(shù)、繪制泳道間遺傳圖。

２結(jié)果與分析

２．１對(duì)二氯苯處理４ ｄ后濕地土壤細(xì)菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

圖１為不同濃度對(duì)二氯苯處理土壤４ ｄ后土壤細(xì)菌群落ＤＧＧＥ分析結(jié)果。由圖1可知，試驗(yàn)初期，不同濃度對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤細(xì)菌群落的基因條帶出現(xiàn)較明顯的差別。與對(duì)照相比，低濃度對(duì)二氯苯脅迫下條帶變化不大，但其中條帶ａ、ｂ亮度變暗消失，條帶ｃ、ｄ亮度增加。表明濕地土壤中大多數(shù)細(xì)菌群落對(duì)低濃度對(duì)二氯苯有一定的耐受性，基本不受影響，甚至對(duì)某類微生物具有一定的刺激作用，產(chǎn)生新條帶，如條帶ｅ。而３６０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)，某些微生物對(duì)較高對(duì)二氯苯脅迫較為敏感，數(shù)量大大降低，達(dá)到ＤＧＧＥ分辨率下限。電泳圖譜泳道間的遺傳簇關(guān)系（圖２）同樣印證了上述結(jié)果，在圖２中，對(duì)二氯苯濃度為１２０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)與對(duì)照最為接近，第３、第４和第５泳道則與對(duì)照的相似性為５７．８％～７５．０％，較處理初期時(shí)明顯降低。隨著土壤中對(duì)二氯苯濃度的增加，土壤中細(xì)菌群落基因多樣性受到的影響也逐漸增強(qiáng)，到土壤對(duì)二氯苯濃度為２４０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)，整個(gè)泳道條帶出現(xiàn)明顯差別。值得注意的是，在土壤處理４ ｄ時(shí)，２４０ ｍｇ／ｋｇ對(duì)二氯苯濃度下，出現(xiàn)一條新增條帶，而對(duì)照及其他濃度下土壤都沒(méi)有，說(shuō)明土壤中可能有在對(duì)二氯苯較高濃度下良好生長(zhǎng)的微生物種。

２．２對(duì)二氯苯處理１８ ｄ土壤細(xì)菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

圖３為不同濃度對(duì)二氯苯處理１８ ｄ土壤中細(xì)菌群落ＤＧＧＥ分析結(jié)果。由圖3可知，在處理１８ ｄ時(shí)，與對(duì)照相比，１２０ ｍｇ／ｋｇ對(duì)二氯苯脅迫與對(duì)照土壤的細(xì)菌群落有７７．４％的相似性，再次說(shuō)明濕地土壤中大多數(shù)細(xì)菌對(duì)對(duì)二氯苯有耐受性，另一些細(xì)菌則受到了抑制，表現(xiàn)出條帶亮度變暗，如圖３中的條帶ａ、ｂ。第３和第４泳道上出現(xiàn)的條帶ｃ則表明在２４０ ｍｇ／ｋｇ和３６０ ｍｇ／ｋｇ濃度下有適應(yīng)該濃度的細(xì)菌，在２４０ ｍｇ／ｋｇ濃度處理４ ｄ時(shí)出現(xiàn)的新條帶反映的可能是此種細(xì)菌，隨著土壤中對(duì)二氯苯的揮發(fā)，原來(lái)３６０ ｍｇ／ｋｇ濃度降低至該種細(xì)菌能適應(yīng)的濃度。由處理１８ ｄ時(shí)電泳圖譜泳道間的遺傳簇關(guān)系（圖４）可見(jiàn)，第２、第３和第４泳道與對(duì)照的相似性為７３．４％～７６．５％，較處理初期相比有所提升，而對(duì)二氯苯含量６００ ｍｇ／ｋｇ的相似性也從處理初期的６２．７％提高到了６９．４％。造成這種情況的原因可能是隨著對(duì)二氯苯的在土壤中的降解以及揮發(fā)，在土壤中的有效濃度降低，微生物的生長(zhǎng)受到的抑制作用減小所引起的。值得注意的是，在土壤處理１８ ｄ時(shí)，原來(lái)在２４０ ｍｇ／ｋｇ濃度時(shí)出現(xiàn)的新條帶也在３６０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)出現(xiàn)了，而對(duì)照及其他處理都沒(méi)有，更加肯定了此種微生物能適應(yīng)土壤中適宜的對(duì)二氯苯濃度。

２．３對(duì)二氯苯處理４５ ｄ土壤細(xì)菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

對(duì)二氯苯處理４５ ｄ時(shí)土壤細(xì)菌群落ＤＧＧＥ電泳圖譜與處理４ ｄ時(shí)相比發(fā)生了較大的改變，各濃度對(duì)二氯苯處理下條帶數(shù)目有所增加（圖５），在土壤培養(yǎng)４５ ｄ時(shí)，不同處理土壤樣品之間差異開(kāi)始變小，對(duì)二氯苯濃度為１２０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)譜型與對(duì)照的相似性為８４．３％，但亮度稍變暗；對(duì)二氯苯濃度為３６０ ｍｇ／ｋｇ時(shí)譜型與對(duì)照的相似度達(dá)到７１．５％。圖６中不同處理譜型與對(duì)照的相似性都在７０．０％以上，其中１２０ ｍｇ／ｋｇ處理時(shí)更是達(dá)到８４．３％。表明在土壤培養(yǎng)４５ ｄ時(shí)，不同對(duì)二氯苯濃度的土壤樣品之間的差異開(kāi)始變小。

３結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同處理時(shí)間、不同濃度對(duì)二氯苯脅迫下濕地土壤的細(xì)菌群落總ＤＮＡ進(jìn)行ＤＧＧＥ多樣性分析，結(jié)果表明，不同濃度對(duì)二氯苯對(duì)濕地土壤細(xì)菌組成產(chǎn)生了明顯影響。不同濃度對(duì)二氯苯不僅影響了組成細(xì)菌群落的細(xì)菌種群數(shù)目，還使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性發(fā)生了改變。說(shuō)明土壤細(xì)菌群落中各個(gè)種群是相互作用的，各土壤樣品細(xì)菌群落遺傳多樣性是對(duì)各種群的群體性反映。但是細(xì)菌群落遺傳多樣性并不是簡(jiǎn)單地隨著對(duì)二氯苯濃度提高而減小。在較低濃度對(duì)二氯苯污染的樣點(diǎn)，ＤＧＧＥ圖譜條帶數(shù)目雖然變化不大，但組成圖譜的條帶亮度不同。說(shuō)明不同種類的細(xì)菌不僅對(duì)對(duì)二氯苯的敏感性不同，而且對(duì)不同程度的對(duì)二氯苯污染敏感性也不同?？紤]到細(xì)菌種群之間諸如偏利、協(xié)同、共生、偏害、競(jìng)爭(zhēng)等復(fù)雜的關(guān)系，可能是一定程度的對(duì)二氯苯污染改變了群落內(nèi)部種群之間的關(guān)系，某些對(duì)對(duì)二氯苯敏感的細(xì)菌的消亡或者一些耐受對(duì)二氯苯的細(xì)菌產(chǎn)生的抗性保護(hù)了其他種群的細(xì)菌。細(xì)菌群落的耐受性可能是因?yàn)楹筇爝m應(yīng)、基因突變或者通過(guò)群落結(jié)構(gòu)中種群組成的改變而更具有耐受性。對(duì)二氯苯污染土壤微生態(tài)環(huán)境與細(xì)菌多樣性的內(nèi)在關(guān)系主要表現(xiàn)在作用與反作用、抑制與適應(yīng)、穩(wěn)定與變異、誘導(dǎo)與重建的相互依存、相互影響、共同演化，其結(jié)果使得適應(yīng)對(duì)二氯苯脅迫環(huán)境的優(yōu)勢(shì)菌群得以保留，群落結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化，耐受性提高。

在研究中，在土壤處理初期含對(duì)二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培養(yǎng)土中出現(xiàn)一條新增條帶，為對(duì)照及其他處理土壤所沒(méi)有，處理后期隨著對(duì)二氯苯濃度降低而消失，說(shuō)明土壤中存在著適應(yīng)對(duì)二氯苯適宜濃度而良好生長(zhǎng)的細(xì)菌。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＡＲＴＵＲＳＳＯＮ１ Ｖ， ＦＩＮＬＡＹ Ｒ Ｄ， ＪＡＮＳＳＯＮ Ｊ Ｋ． Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］． Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，８（１）：１-１０．

［２］ ＦＩＥＲＥＲ Ｎ， ＢＲＡＤＦＯＲＤ Ｍ Ａ， ＴＯＷＡＲＤ Ｊ Ｒ Ｂ． Ａｎ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００７，８８：１３５４-１３６４．

［３］ 車振明．微生物學(xué)［Ｍ］．武漢：華中科技大學(xué)出版社，２０１０．２４３-２６１．

［４］ ＦＥＲＲＡＲＩ Ｂ Ｃ， ＢＩＮＮＥＲＵＰ Ｓ Ｊ， ＧＩＬＬＩＮＧＳ Ｍ． Ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｓｏｉｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｓｅｌｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，７１ （１２）：８７１４-８７２０.

［５］ ＷＡＬＬＩＳ Ｐ Ｄ， ＨＡＹＮＥＳ Ｒ Ｊ， ＨＵＮＴＥＲ Ｃ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌａｎｄ ｕｓｅ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｏｉｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１０，４６：１４７-１５０．

［６］ ＣＨＯＮＧ Ｃ Ｗ， ＴＡＮ Ｇ Ｙ Ａ， ＷＯＮＧ Ｒ Ｃ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ＤＧＧＥ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｉｌｓ ｆｒｏｍ ｅｉｇｈｔ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｔｅｓ ａｒｏｕｎｄ Ｃａｓｅｙ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ［Ｊ］． Ｐｏｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００９， ３２：８５３-８６０．

［７］ 李娜，林曉珊，張毅． ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術(shù)分析倒置Ａ２／Ｏ工藝處理染織廢水中的微生物區(qū)系［Ｊ］．環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，２０１０，３０（３）：４９０-４９６．

［８］ 奧斯伯Ｆ Ｍ，金斯頓Ｒ Ｅ，賽德曼Ｊ Ｇ， 等． 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［Ｍ］．第三版． 顏?zhàn)臃f，王海林，譯．北京：科學(xué)出版社，１９９８．

［９］ ＨＥＵＥＲ Ｈ， ＫＲＳＥＫ Ｍ， ＢＡＫＥＲ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｂｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １６Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，６３：３２３３-３２４１．

（責(zé)任編輯鄭威）

收稿日期：２０１１－１０－２４

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ＢＫ２００９１７１）；江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”基金項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：徐文品（1986-），男，甘肅蘭州人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境污染治理技術(shù)，（電話）１３０９２１７８０８９（電子信箱）ｘｘｘｘ１２１４４＠１２６．ｃｏｍ；

通訊作者，丁成，教授，博士，主要從事環(huán)境污染治理技術(shù)研究工作，（電話）１３８１５５８８０１１（電子信箱）１３８１５５８８０１１＠163．ｃom。