酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV抗體影響因素探討

畢秀欣

[摘要] 通過(guò)對(duì)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HIV抗體的檢測(cè)前、檢測(cè)中和檢測(cè)后各相關(guān)影響因素的分析，探討各因素對(duì)結(jié)果的影響，以便尋找解決的方法和加強(qiáng)質(zhì)控管理，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確性。

[關(guān)鍵詞] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；HIV抗體；影響因素

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446.61[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）02-0076-02

The impact factors of enzyme-linked immunosorbent assay in detection of HIV antibodies

BI Xiuxin

International Travel Health Care Center of Dandong in Liaoning Province, Dandong 118000, China

[Abstract] By analysis of all relevant factors in pre-test, during test and post-test of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detection of HIV antibodies, to explore the various impact factors on the results, in order to find a solution and strengthen the quality control management, to ensure accuracy and precision of the test results.

[Key words] ELISA; HIV antibody; Impact factors

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、價(jià)格低廉等特點(diǎn)成為HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)的常用方法。優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器、正確的操作和高素質(zhì)的技術(shù)人員是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。由于ELISA法檢測(cè)結(jié)果受很多因素影響，其中任何一項(xiàng)因素都可造成HIV抗體結(jié)果假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。因此必須加強(qiáng)HIV抗體初篩實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。筆者從事多年的HIV抗體檢測(cè)工作，現(xiàn)將影響因素分析如下。

1 檢測(cè)前

1.1 試劑

1.1.1 試劑的選擇優(yōu)質(zhì)的HIV抗體試劑是結(jié)果質(zhì)量的基礎(chǔ)。試劑要從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便性、安全性和經(jīng)濟(jì)性做出全面的評(píng)價(jià)并選擇好的試劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求選擇靈敏度高（精密度高，CV值＜15%）、特異性好的試劑。試劑的選擇很關(guān)鍵，通過(guò)廠家了解試劑包被物的組成，如原料來(lái)源（基因組成或合成多肽）、片段組成（按比例組成或化合組成）、片段長(zhǎng)短等來(lái)判斷抗原、抗體包被的完整性和特異性。根據(jù)試劑批號(hào)檢定報(bào)告了解其質(zhì)量水平和試劑的優(yōu)劣，還可以室間質(zhì)評(píng)報(bào)告中對(duì)試劑的評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)客觀評(píng)價(jià)、選擇適合實(shí)驗(yàn)室的試劑。要選擇和訂購(gòu)長(zhǎng)效批號(hào)的試劑，避免試劑批號(hào)改變而重新建立質(zhì)量控制體系[1]。

1.1.2 試劑的儲(chǔ)存試劑應(yīng)儲(chǔ)存在2～8℃冰箱中，力求溫度恒定，并防止陽(yáng)光照射。試劑盒中有3個(gè)主要的試劑，即免疫吸附劑、酶結(jié)合物和底物。酶結(jié)合物具有生物活性，保存不當(dāng)，極易失活；底物容易被氧化，產(chǎn)生顏色。因此，必須加強(qiáng)試劑的儲(chǔ)存管理，防止試劑失活和氧化。

1.2 標(biāo)本

血清是最常用的標(biāo)本。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的質(zhì)量也是影響結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，標(biāo)本的干擾物質(zhì)容易引起假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。干擾分為外源性和內(nèi)源性。外源性干擾：細(xì)菌污染、溶血、凝固不全、反復(fù)凍融和標(biāo)本相互污染等；標(biāo)本放置4℃冰箱冷藏一般不超過(guò)5 d，如果保存過(guò)久，其中的蛋白質(zhì)可能發(fā)生聚合，可使本底加深；凍結(jié)的標(biāo)本要融化后充分混勻，為防止蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡；渾濁或有沉淀的樣本應(yīng)先離心澄清后再檢測(cè)；防止反復(fù)凍融，引起效價(jià)降低。內(nèi)源性干擾：一般包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過(guò)選擇合適的試劑。①標(biāo)本溶血時(shí)釋放大量具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，增加了非特異顯色，干擾測(cè)定結(jié)果[2]；②標(biāo)本被細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)；③血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因凝固不全、纖維蛋白原非特異吸附于微孔內(nèi)而造成假陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 儀器

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到移液器、水浴箱或恒溫箱、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀等。移液器是一種比較精密的工具，要求比較高，必須定期對(duì)加樣器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)[3]。每次加樣需更換吸嘴，以免交叉污染。水浴箱溫度要準(zhǔn)確恒定；洗板機(jī)要定期維護(hù)，檢測(cè)殘液量。

2 檢測(cè)中

2.1 加樣

在HIV抗體檢測(cè)中加樣3次，即加標(biāo)本、加酶結(jié)合物、加底物。加樣時(shí)要將所加物加入板孔底部，避免加在孔壁外部，產(chǎn)生氣泡，吸取樣品速度要均勻，保證加樣量準(zhǔn)確；加完樣品要在微量振蕩器上震蕩1min以保證混合均勻。

2.2 溫育的時(shí)間和溫度

要力求保證溫育的時(shí)間和溫度，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)屬于固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相的表面發(fā)生，樣品中的抗體并不是都有均等的機(jī)會(huì)與固相的抗原結(jié)合，而是最貼近孔壁的一層溶液中的直接與抗原接觸，是一個(gè)逐漸平衡的過(guò)程，因此需要經(jīng)過(guò)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)，要保證足夠的溫育時(shí)間，才能使產(chǎn)物生成達(dá)到頂峰，有的實(shí)驗(yàn)室為加快速度，提高反應(yīng)溫度，但盲目提高溫度會(huì)影響酶的活性。

2.3 溫育的方式

常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致周?chē)着c中央孔結(jié)果的吸光度差異（即邊緣效應(yīng)），可將ELISA板置于水浴箱中。無(wú)論溫育還是水浴，反應(yīng)板不可疊放，以保證各板的溫度盡快達(dá)到平衡，反應(yīng)板要貼近水面，溫育時(shí)要防止揮發(fā)或水珠濺入影響結(jié)果。

2.4 洗滌

洗滌雖然不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但也影響實(shí)驗(yàn)的成敗。洗滌的目的是分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物，通過(guò)洗滌來(lái)實(shí)現(xiàn)清除殘留在板孔中的沒(méi)能與固相抗原結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，洗液的配制要按照要求，太濃會(huì)解離包被在固相的抗原，過(guò)低削弱洗滌效果?？梢哉f(shuō)洗滌是HIV抗體ELISA法檢測(cè)的最主要的技術(shù)，操作者要嚴(yán)格按照要求洗滌，不能馬虎，否則前功盡棄。洗滌包括儀器自動(dòng)洗滌和手工洗滌。儀器洗滌要注意定期檢測(cè)殘余量，檢測(cè)吸液針和注液針是否堵塞，及時(shí)更換洗液和廢液，防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起細(xì)菌污染和廢液倒流；手工洗滌包括有浸泡式和流水沖洗式兩種。手工洗板要注意孔間的交叉污染和洗滌間隔時(shí)間。

2.5 顯色與比色

顯色是ELISA法中最后一步溫育反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間和溫度仍是影響顯色的因素。TMB受光照影響不大，但OPD底物受光照會(huì)自行變色，因此，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行。顯色的溫度和時(shí)間要力求準(zhǔn)確充分，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)比色，防止時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)褪色。比色時(shí)應(yīng)盡量選用雙波長(zhǎng)進(jìn)行比色，這樣可以排除干擾，比色前要用吸水紙拭干板底附著的液體，防止孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾。

3 質(zhì)量控制

3.1 開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）

室內(nèi)質(zhì)量控制程序，每次或每天之間不可能沒(méi)有誤差，決定允許的誤差范圍以臨床上不造成誤診和漏診為準(zhǔn)，選擇一個(gè)弱陽(yáng)性的室內(nèi)質(zhì)量控制品，其S/CO值應(yīng)該為2～4之間。利用L-J質(zhì)量控制圖，認(rèn)真分析每次的失控的原因，要解決失控，必須分析造成失控是隨機(jī)的還是系統(tǒng)的很重要，隨機(jī)誤差表現(xiàn)離散度增大，而系統(tǒng)誤差逐漸產(chǎn)生，如漂移或者傾向性，如果是系統(tǒng)誤差，再對(duì)系統(tǒng)誤差進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)室每月、每一季度要對(duì)室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，對(duì)當(dāng)月的均值、變異系數(shù)等進(jìn)行比對(duì)分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，及時(shí)采取糾正措施來(lái)提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

3.2 外部質(zhì)量控制

積極參加室間質(zhì)評(píng)能力驗(yàn)證活動(dòng)，通過(guò)室間質(zhì)評(píng)和能力驗(yàn)證，利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)或校準(zhǔn)能力的活動(dòng)，判斷和監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制方法，有效消除偏差，對(duì)分析結(jié)果起到校準(zhǔn)和復(fù)核作用。有效地實(shí)施能力驗(yàn)證，在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中起著非常重要的作用。利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)和能力驗(yàn)證來(lái)不斷提升實(shí)驗(yàn)室的能力。

3.3 加強(qiáng)人員培訓(xùn)

人員是實(shí)驗(yàn)室最寶貴的資源，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室水平的高低很大程度上取決于人員的素質(zhì)，尤其是關(guān)鍵的技術(shù)崗位人員，因此，有針對(duì)性地加強(qiáng)人員培訓(xùn)，對(duì)艾滋病初篩實(shí)驗(yàn)室是非常重要的[4]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]于振喜，李連潔. 用ELISA法檢測(cè)HIV抗體時(shí)如何避免“花板”[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，3（23）：56.

[2]陳云鈺. ELISA法檢測(cè)HIV抗體需注意的影響因素[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（6）：1564-1565.

[3]全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范（2009年修訂版）[S]. 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心，2009：1-5.

[4]張斌. 實(shí)驗(yàn)室管理、認(rèn)可與運(yùn)作[M]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005：162-164.

（收稿日期：2011-11-18）