SRAP標(biāo)記在夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度檢測中的應(yīng)用

黃建都 邵貴榮 陳文輝 方淑桂 鐘開勤

摘 要： 應(yīng)用SRAP技術(shù)對(duì)夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度進(jìn)行了分子檢測研究。結(jié)果表明，從100對(duì)SRAP引物中篩選出1對(duì)引物（Me-5/Em-8）能清晰地?cái)U(kuò)增出父、母本的特異性條帶，并且F1代帶型呈雙親互補(bǔ)。利用這對(duì)SRAP引物對(duì)夏華2號(hào)種子進(jìn)行純度檢測，檢測純度為97%，與田間生物學(xué)性狀表現(xiàn)相符合，表明SRAP技術(shù)可用于夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度鑒定。

關(guān)鍵詞： 甘藍(lán)； 夏華2號(hào)； SRAP； 種子純度

Genetic Purity Test of Cabbage Xiahua No. 2 Using SRAP Markers

HUANG Jian-du， SHAO Gui-rong， CHEN Wen-hui， FANG Shu-gui， ZHONG Kai-qin

（Fuzhou Vegetable Research Institute， Fuzhou， Fujian， 350111， China）

Abstract： This experiment was conducted to test the genetic purity of cabbage hybrid Xiahua No. 2 by using SRAP markers. A pair of primers（Me-5/Em-8）produced polymorphism between the parents and repeatable co-dominant bands, among 100 pairs of SRAP primers tested. The genetic purity 97% of a seed lot of hybrid Xiahua No. 2 revealed by the SRAP markers is very similar to the result of field grown-out test. The results showed that the SRAP markers can be used in genetic purity test of cabbage hybrid Xiahua No. 2.

Key words： Cabbage（Brassica oleracea var. capitata）； Xiahua No. 2； SRAP； Seed Purity

夏華2號(hào)是福州市蔬菜科學(xué)研究所選育的甘藍(lán)新品種，表現(xiàn)出生長強(qiáng)勢整齊、結(jié)球性好、抗病、高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大菜農(nóng)的喜愛。該品種于2011年通過福建省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定（閩認(rèn)菜2011009）。為了確保種子質(zhì)量，銷售前必須對(duì)種子進(jìn)行純度檢測，傳統(tǒng)上對(duì)種子的檢測方法是利用田間生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定，但是采用此方法周期長且容易受到外界環(huán)境的影響，可靠性較低。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，已有RAPD [1-3]、AFLP[4-5]、SRAP[3，6]分子標(biāo)記應(yīng)用于種子純度的鑒定。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)種子純度進(jìn)行鑒定是基于DNA水平上的鑒定，可以從本質(zhì)上反映親本之間以及親本與子代之間的差異，且不受外界環(huán)境因素的影響，可快速、準(zhǔn)確地應(yīng)用于種子純度的鑒定。SRAP是由Li 和 Quiros[7]于2001年提出并發(fā)展的一種新型分子標(biāo)記，具有操作簡單、中等產(chǎn)量、高共顯性、高重復(fù)性、在基因組中分布均勻、易于分離條帶及測序等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于多種作物的種子純度鑒定。本研究利用SRAP技術(shù)對(duì)甘藍(lán)新品種夏華2號(hào)種子純度進(jìn)行分析鑒定和研究，結(jié)合田間生物學(xué)性狀觀察結(jié)果，擬為夏華2號(hào)甘藍(lán)提供一種快速、準(zhǔn)確、實(shí)用、可靠的檢測方法，也可為其他甘藍(lán)品種種子純度鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為本所甘藍(lán)課題選育的新品種夏華2號(hào)及其父、母本，其中母本是細(xì)胞質(zhì)雄性不育系NBB10-87，父本是優(yōu)良自交系107-1。Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR buffer（含Mg2+）、DL-2000 marker等試劑購自上海申能博彩生物公司，SRAP引物根據(jù)Li和Quiros[7]的設(shè)計(jì)原理，由上海生物技術(shù)工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘藍(lán)育苗及DNA的提取與檢測 2011年4月將供試品種夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本進(jìn)行穴盤育苗并用遮陽網(wǎng)覆蓋避光，待真葉長至2~3片時(shí)，隨機(jī)抽取夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本各15株，摘取展開的健康嫩葉，并混合，采用改良的CTAB法[8]提取總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測定OD值，檢測DNA的質(zhì)量和濃度，并稀釋到30 ng·μL-1作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系 SRAP-PCR反應(yīng)體系參考單曉政等的反應(yīng)體系[9]：總體積為25 μL，包含10×PCR buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP 0.25 mmol·L-1，上下游引物各0.4 μmol·L-1，Taq polymerase 1.5 U，DNA 30 ng，不足的部分由ddH2O補(bǔ)充。PCR擴(kuò)增程序參考劉沖等[10]的方法：94 ℃ 預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性1 min，35 ℃ 退火1min，72 ℃ 延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 變性1min，50 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析檢測用2% 瓊脂糖，電泳電壓為120 V，時(shí)間 80 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行檢測拍照。

1.2.3 多態(tài)性引物的篩選 利用夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本的混合DNA對(duì)100對(duì)SRAP引物對(duì)進(jìn)行篩選，篩選出條帶清晰的多態(tài)性引物用于種子純度鑒定。

1.2.4 田間種植鑒定與分子標(biāo)記鑒定 將同批次夏華2號(hào)及其父、母本種子于2011年6月播種在福州市閩侯縣大洋鄉(xiāng)高山反季節(jié)蔬菜基地（海拔700 m）。幼苗期隨機(jī)選取200株進(jìn)行編號(hào)，利用篩選出的SRAP特異引物對(duì)甘藍(lán)幼苗進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增檢測，并將幼苗及其父、母本定植于大田中。至9月中旬采收期，參照甘藍(lán)種質(zhì)資源描述規(guī)范與技術(shù)規(guī)程[11]測量夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父母本的外葉數(shù)量、開展度、生育期、蠟粉量、球高、球?qū)捯约爸行闹?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

利用混合DNA對(duì)SRAP的10個(gè)上游引物（Me1-Me10）和10個(gè)下游引物（Em1-Em9和Em12）組成的100對(duì)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增篩選，圖1為12對(duì)SRAP 引物對(duì)甘藍(lán)擴(kuò)增的指紋圖譜。結(jié)果表明，大部分的SRAP引物均能在250~2 000 bp擴(kuò)增出條帶，平均每條引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)目為4~5條。選擇條帶較為清晰并且條帶數(shù)量較多的引物對(duì)夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，結(jié)果選出5對(duì)可以擴(kuò)增出夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母的特異性條帶的引物，分別為Me3/Em2、Me4/Em3、Me5/Em8 、Me8/Em6和Me9/Em7（表2）。

表2 不同SRAP引物對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性

2.2 甘藍(lán)的特異性標(biāo)記

利用篩選出的5對(duì)引物組合對(duì)夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果表明，每對(duì)引物最少能擴(kuò)增出1條父本或母本的多態(tài)性條帶，其中Me3/Em2表現(xiàn)出偏父性，Me4/Em3、 Me8/Em6和Me9/Em7表現(xiàn)出偏母性，Me5/Em8能擴(kuò)增出父母本互補(bǔ)的帶型。經(jīng)過多次擴(kuò)增反復(fù)試驗(yàn)，Me5/Em8擴(kuò)增圖譜差異很少，說明引物可靠性和穩(wěn)定性較高，Me5/Em8在650 bp左右有母本和F1代特異性條帶，為偏母型；在1 000 bp左右有父本和F1代特異性條帶，為偏父型（圖2），由此可以同時(shí)鑒別出父本、母本和F1代。

2.3 SRAP標(biāo)記與田間種植鑒定結(jié)果的比較

利用引物Me5/Em8對(duì)200株夏華2號(hào)甘藍(lán)進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記檢測。結(jié)果表明，有5個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物有母本特異性條帶，但沒有父本特異性條帶；有1個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物既沒有父本特異性條帶，也沒有母本特異性條帶。SRAP檢測結(jié)果表明夏華2號(hào)種子純度為97%。

將200株夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本種植于大田中，觀察得到其生物學(xué)性狀如表2。結(jié)果顯示，在存活的177株夏華2號(hào)甘藍(lán)中有8株表現(xiàn)為蠟粉量、球高、球?qū)捄椭行闹刃誀钆c夏華2號(hào)甘藍(lán)及其親本的性狀均不相同。田間檢測結(jié)果表明夏華2號(hào)種子純度為95.5%。室內(nèi)分子鑒定與田間性狀觀察結(jié)果基本一致。

表2 夏華2號(hào)甘藍(lán)及其父、母本

主要田間生物學(xué)性狀比較

3 討 論

本試驗(yàn)是利用SRAP標(biāo)記與田間種植2種方法鑒定種子純度，結(jié)果表明夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度均未達(dá)到100%，兩者的結(jié)果基本一致，說明在種子生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了混雜，影響到種子的質(zhì)量。目前在生產(chǎn)上影響種子純度的因素有很多，包括有授粉過程中竄粉、種子采收后機(jī)械混雜、親本純度和母本育性的穩(wěn)定程度等[12]。

本研究對(duì)夏華2號(hào)種子純度進(jìn)行檢測過程中發(fā)現(xiàn)，田間生物學(xué)性狀觀察結(jié)果不但速度慢，而且還會(huì)由于環(huán)境因素影響，存在死苗缺株現(xiàn)象，影響檢測結(jié)果；同時(shí)無法從表型觀察結(jié)果判斷引起種子純度下降的原因。而SRAP標(biāo)記結(jié)果顯示，影響夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度的主要因素是可能在留種過程中外界甘藍(lán)類蔬菜花粉引起的竄粉，占總混雜比例的66.7%；其次是在種子收獲后由其他種子引起的機(jī)械混雜，占總混雜比例的33.3%。因此在種子生產(chǎn)過程中首先要嚴(yán)格做好隔離工作，防止外界甘藍(lán)類花粉進(jìn)入留種地；其次是種子收獲后應(yīng)該正確整理種子，避免不同種子之間相互混雜。本試驗(yàn)研究表明，分子標(biāo)記技術(shù)不僅可以快速、準(zhǔn)確地檢測種子純度，而且能夠?yàn)槲覀冊(cè)诜N子生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制提供指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度進(jìn)行鑒定時(shí)，從100對(duì)SRAP引物中篩選出5對(duì)引物可以用于夏華2號(hào)甘藍(lán)。其中Me5/Em8可以同時(shí)擴(kuò)增出父本和母本的特異性條帶，F(xiàn)1代能同時(shí)擴(kuò)增出父、母本的特異性帶型。運(yùn)用此對(duì)引物對(duì)苗期夏華2號(hào)甘藍(lán)種子純度進(jìn)行SRAP鑒定和田間種植采收期的生物學(xué)性狀觀察結(jié)果基本相符。

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收稿日期： 2011-11-14

基金項(xiàng)目： 福建省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)專題[2008NZ0002-1（1）]； 福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008N0046）

作者簡介： 黃建都，男，研究實(shí)習(xí)員，研究方向： 蔬菜育種。電話： 15859109091； 電子信箱： hjd_2003@163.com

通訊作者： 陳文輝，男，研究員，電子信箱： CWH1227@126.com