放線菌WS—13661活性產(chǎn)物的快速鑒別

萬(wàn)中義　張亞妮等

摘要：放線菌ＷＳ－１３６６１的代謝產(chǎn)物對(duì)農(nóng)業(yè)病原真菌具有很強(qiáng)的抑制活性。試驗(yàn)對(duì)其ＨＰＬＣ半制備組分進(jìn)行生物測(cè)定，表明其活性部位在１５～２０ｍｉｎ；根據(jù)ＨＰＬＣ及ＵＶ圖譜確定其活性成分為五烯類化合物，對(duì)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定了其分子離子峰，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定其活性成分為欽氏菌素衍生物。

關(guān)鍵詞：放線菌ＷＳ－１３６６１；天然產(chǎn)物；快速鑒別；欽氏菌素

中圖分類號(hào)：ＴＱ４６０；Ｒ９１５ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）24－5658-04

放線菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物是生物農(nóng)藥研究開發(fā)的重要來源［１，２］，一方面，放線菌可直接通過發(fā)酵產(chǎn)生天然產(chǎn)物制成生物農(nóng)藥，如阿維菌素［３－５］、多殺菌素［６］、井岡霉素［７，８］等，另一方面，以其天然產(chǎn)物為模板，對(duì)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化改造，是研發(fā)高效低毒綠色農(nóng)藥的另一途徑，如阿米西達(dá)［９］就是以真菌產(chǎn)生的Ｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎ［１０］為先導(dǎo)化合物經(jīng)人工改造而獲得的。然而，隨著對(duì)環(huán)境中放線菌資源的不斷挖掘，重復(fù)發(fā)現(xiàn)已知化合物的幾率越來越大，獲得新活性化合物的難度越來越大。據(jù)湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心統(tǒng)計(jì)，從隨機(jī)篩選工作中得到新化合物的概率在１％以下，這就說明，９９％以上的活性化合物為已知成分。因此，從大量樣品中快速鑒定活性化合物成為生物農(nóng)藥篩選的關(guān)鍵。

ＷＳ－１３６６１是湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從湖南省石門地區(qū)采集的土樣中分離到的一株放線菌。其發(fā)酵提取物經(jīng)生物測(cè)定，對(duì)多種農(nóng)業(yè)病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。經(jīng)對(duì)發(fā)酵提取物進(jìn)行ＨＰＬＣ制備及自動(dòng)收集，獲得了不同時(shí)間流出的樣品共３６份，經(jīng)生物測(cè)定，確定其活性成分在１４～２１ｍｉｎ，經(jīng)ＨＰＬＣ－ＭＳ分析，結(jié)合天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，快速鑒定出了活性產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌種 放線菌ＷＳ－１３６６１，分離自湖南省石門地區(qū)山地渣土，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保藏。生測(cè)用指示菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａｎｏｄｏｒｕｍ，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。

１．１．２ 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基為ＩＳＰ－２瓊脂培養(yǎng)基，１８ｍｍ×１８０ｍｍ玻璃試管每管裝培養(yǎng)基８～１０ｍＬ。種子培養(yǎng)基為ＩＳＰ－２不加瓊脂，５００ｍＬ帶擋板三角瓶每瓶裝培養(yǎng)基１００ｍＬ，１２１℃滅菌３０ｍｉｎ。發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分為葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等，５００ｍＬ帶擋板三角瓶每瓶裝培養(yǎng)基１００ｍＬ，１２１℃滅菌３０ｍｉｎ。

１．１．３ 主要設(shè)備 Ｌｙ－０．８型冰凍干燥機(jī)，上海東富龍科技有限公司生產(chǎn)；Ｗａｔｅｒｓ高效制備色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ２５２５泵、Ｗａｔｅｒｓ２７６７自動(dòng)收集系統(tǒng)、Ｗａｔｅｒｓ２９９６二極管陣列式檢測(cè)器）；Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ２９９６二極管陣列式檢測(cè)器）；ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏｍｉｃｒｏ質(zhì)譜儀（電噴霧離子源ＥＳＩ）；ＭａｓｓｌｙｎｘＶ４．１液質(zhì)聯(lián)用分析軟件；查普曼（Ｃｈａｐｍａｎ）天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)（２００３版）。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株搖瓶發(fā)酵 在嚴(yán)格無菌條件下從斜面培養(yǎng)基上?。浮保埃恚恚驳囊粔K菌苔轉(zhuǎn)移至種子培養(yǎng)基搖瓶中，２８℃１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)７２～９６ｈ，然后按１０％的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，２８℃，１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)１００～１２０ｈ，即完成發(fā)酵。

１．２．２ 發(fā)酵液的凍干及提取 將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至不銹鋼凍干杯中，置凍干機(jī)中干燥，凍干條件為－４０℃預(yù)凍２ｈ，冷阱預(yù)冷至－４５℃以下，開啟真空泵升華（真空度１０～３０Ｐａ，升溫速率２～３℃／ｈ，極限溫升３７℃）。取出凍干粉轉(zhuǎn)移至三角瓶中，先用少量５０％甲醇濕潤(rùn)，再加入１００ｍＬ乙酸乙酯，于搖床上１８０ｒ／ｍｉｎ振蕩萃?。保瑁蛛x出酯相，旋蒸除去溶劑，再以少量甲醇溶解后送ＨＰＬＣ－ＭＳ分析。

１．２．３ 提取物的生物活性測(cè)定 取一定量發(fā)酵提取物加入ＤＭＳＯ溶解，以乙醇稀釋至一定濃度后，用９６孔板進(jìn)行生物測(cè)定。組分生物測(cè)定采用同樣的生測(cè)靶標(biāo)及方法。

１．２．５ 提取物的鑒別 根據(jù)組分生物測(cè)定結(jié)果確定活性成分的保留時(shí)間，從ＨＰＬＣ圖譜中獲得活性物質(zhì)的紫外吸收光譜，從而確定吸收峰的波長(zhǎng)。從ＥＳＩ圖譜中可判定目標(biāo)產(chǎn)物的分子離子峰。將吸收峰波長(zhǎng)及相對(duì)分子質(zhì)量輸入Ｃｈａｐｍａｎ天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢同該物質(zhì)性質(zhì)相同或相近的化合物名稱及其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行理化及生物學(xué)性質(zhì)比對(duì)，從而確定活性化合物的種類及其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

２ 結(jié)果與分析

２．３ ＷＳ－１３６６１活性產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

２．４ 活性產(chǎn)物的快速鑒定

３ 小結(jié)與討論

有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的鑒定通常需要四大譜分析，即紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜，紅外光譜提供了化合物分子振動(dòng)的信息，紫外光譜則是分子內(nèi)部電子能級(jí)躍遷的結(jié)果，質(zhì)譜提供了分子離子及其碎片的信息，而核磁共振譜則體現(xiàn)了化合物中化學(xué)鍵的關(guān)系。紅外光譜及核磁共振譜的獲得需要有一定量的純化合物（純度９５％以上，質(zhì)量２ｍｇ以上），而放線菌活性物質(zhì)純化合物的獲得需要進(jìn)行發(fā)酵、提取、精制等過程，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因而采用四大譜聯(lián)合進(jìn)行化合物的鑒定非常耗時(shí)，一般鑒定１個(gè)化合物需要一至數(shù)月。

在微生物源天然產(chǎn)物資源的篩選過程中，篩選得到的絕大多數(shù)活性化合物為已知化合物，對(duì)每一種活性化合物進(jìn)行四大譜分析費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而分析結(jié)果多數(shù)證明是一已知化合物。因此，在篩選過程中進(jìn)行化合物的早期鑒別非常重要。

多烯類化合物由于其紫外吸收光譜的特殊性，有經(jīng)驗(yàn)的科研人員很易識(shí)別，而且根據(jù)紫外吸收峰的波長(zhǎng)很易判斷其共軛雙鍵數(shù)目，從而確定其屬于四烯、五烯還是七烯類。

在農(nóng)用活性化合物的篩選工作中，多烯類化合物由于抗真菌作用強(qiáng)，被篩選到的幾率非常大?；衔锏脑缙诳焖勹b別對(duì)提高科研工作效率、降低成本具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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［９］袁武棟．阿米西達(dá)——一種獨(dú)特的生物殺菌劑［Ｊ］．四川農(nóng)業(yè)科技，２００３（５）：３４．

［１０］ＡＮＫＥ Ｔ，ＯＢＥＲＷＩＮＫＬＥＲＦ．ＴｈｅｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎｓｎｅｗａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｆｒｏｍｔｈｅＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅＳｔｒｏｂｉｌｕｒｕｓｔｅｎａｃｅｌｌｕｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９７７，３０（１０）：８０６－８１０．