一株產(chǎn)生物活性物質(zhì)放線菌的分離鑒定

詹建立，陳 蕓，陳 濤

（喀什師范學院生物與地理科學系，新疆喀什 840006）

一株產(chǎn)生物活性物質(zhì)放線菌的分離鑒定

詹建立，陳 蕓，陳 濤

（喀什師范學院生物與地理科學系，新疆喀什 840006）

基于16S rRNA序列分析，本文對塔什庫爾干縣土壤中的放線菌進行了初步分離和鑒定。通過平板培養(yǎng)法，對分離鑒定的放線菌菌株進行活性物質(zhì)的分析和研究，從塔縣土壤中分離得到8株放線菌，其中CT-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠抑制Bacillus subtilis。從8株放線菌選出3株16S rRNA的序列分析，推斷放線菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同屬于內(nèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。實驗表明，這3株放線菌雖然來源相同卻有不同的生理生化特性。

塔什庫爾干縣放線菌資源；16S rRNA基因；進化樹；活性物質(zhì)

放線菌（Actinomycetes）是與人類關系極為密切的微生物。從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000種生物活性物質(zhì)中，近70%源自放線菌［1］。目前臨床上使用的抗生素有三分之二來自放線菌［2］。因此，作為一類重要的微生物資源，放線菌的研究受到了世界各國學者的極大重視。其中放線菌的分類鑒定工作是這些研究的基礎。常顯波［3］比較了不同方法的分離效果，并通過純培養(yǎng)和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析對黃海冷水團、北極海區(qū)及青島鹽池的沉積物樣品進行了放線菌多樣性研究。趙邑塵［4］等人研究了青海高寒生態(tài)區(qū)油菜地土壤中放線菌組成及其對油菜菌核病、黑斑病及軟腐病的拮抗性，為克服青海油菜連作障礙提供了放線菌生態(tài)依據(jù)及拮抗性生防放線菌菌株。另外，放線菌多樣性的研究也是一個比較熱門的方向［5-7］。Letek M等人對放線菌的細胞骨架蛋白進行了研究［8］。也有學者探討了放線菌的16SrRNA基因和蛋白質(zhì)的進化關系［9］。

目前，放線菌的研究主要集中在對放線菌來源的生物活性物質(zhì)、放線菌分類學和放線菌遺傳學等方面。塔什庫爾干塔吉克自治縣位于新疆南部，屬寒溫帶干旱氣候區(qū)，極端最高氣溫32.0℃，極端最低氣溫-39.1℃。塔縣的放線菌資源研究尚屬空白，本研究對塔縣放線菌進行分類研究，同時對其生物活性物質(zhì)進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號培養(yǎng)基、明膠液化和淀粉水解實驗等試劑按照文獻［10］配制。

主要試劑：PCR PreMix，EDTA-Na2，Tris，CTAB，EB，SDS和Agarose等購自大連寶生物有限公司（TaKaRa）。

16S rRNA引物：P1（5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和P2（5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）委托上海杰瑞有限責任公司合成。DNA回收使用TaKaRa公司的the Gel Extraction Mini Kit（50次）。

1.2 方法

樣品采樣地點為塔什庫爾干縣土壤。采樣方法、土樣的預處理、土壤懸液制備參考文獻［11］進行，涂布后的平板于28℃恒溫培養(yǎng)1 h后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)（18-24）h。塔什庫爾干縣放線菌的總DNA的提取采用CTAB法［12］。

塔什庫爾干縣放線菌的16S rRNA基因擴增：將總DNA作為PCR擴增的模板，終濃度約為1 nmol/100μL。DNA擴增反應在25μL反應體系中進行，包括9.5μL無菌水，1μL引物P1，1 μL引物P2，12.5μLTaq酶和1μL模板總DNA。PCR反應條件：94℃，3 min；55℃，30 sec；72℃，1 min。

用DNA膠回收試劑盒對塔什庫爾干縣放線菌的16S rRNA基因克隆的產(chǎn)物純化進行回收和純化。委托北京奧科鼎盛有限責任公司對擴增產(chǎn)物進行測序。測序結(jié)果通過http：//www.ncbi. nih.nlm.gov網(wǎng)站進行BLAST序列比對，同時，利用Mega4.1軟件構建系統(tǒng)進化樹。

塔什庫爾干縣放線菌的生理生化實驗如明膠液化、牛乳胨化和淀粉水解等參照文獻［10］進行。然后對塔什庫爾干縣分離到的8株放線菌對Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphylococcus aureus和Bacillus subtilis進行抑菌活性的檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 放線菌的分離與分類

依據(jù)形態(tài)學特征，本研究初步從塔縣土壤中分離得到8株放線菌，對這8株放線菌進行總DNA提取，從中選出3株放線菌的總DNA，分別是CT-1，CT-3和CT-7，對其總DNA進行PCR和膠回收純化，得到約1 500 bp的16S rRNA基因片段（見圖1）。

圖1 分離放線菌菌株的16S rRNA基因片段純化電泳

2.2 放線菌16S rRNA的序列分析

塔縣三株放線菌CT-1，CT-3和CT-7的 16S rRNA基因片段的基因注冊號分別是JQ907274（1 424 bp）、JQ907274（1 422 bp）和JQ907274（1 418 bp）。

本研究通過NCBI網(wǎng)站對擴增的3株放線菌CT-1，CT-3和CT-7菌株的16S rRNA基因序列進行比對。結(jié)果表明，CT-1和CT-3與Paenibacillus sp.（HQ437166）有99%的同源性，且處于同一分支上；CT-7與Paenibacillus xylanexedens在同一個分支上，具有99%的同源性。因此，初步推斷放線菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同屬于內(nèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）（見圖2）。

2.3 放線菌的生理生化實驗

生理生化實驗結(jié)果表明，CT-1水解淀粉，而CT-3和CT-7不能水解淀粉；CT-1，CT-3和CT-7菌株均能使明膠液化，CT-3的液化能力最強，CT-1菌株的液化能力最差；而且CT-1，CT-3和CT-7菌株均能使牛乳酸凝（見表1）。可以看出，3株放線菌雖然分離自同一地點，但是其生理生化性質(zhì)上存在差異。

表1 分離放線菌菌株的生理生化實驗

2.4 放線菌活性物質(zhì)分析

放線菌的部分有效產(chǎn)物對某些菌株具有一定的抑制作用。本研究通過濾紙片點試法對Escherichia coli，Proteus vulgaris，Staphylococcus aureus和Bacillus subtilis四種菌株進行了抑菌實驗。結(jié)果表明，放線菌CT-1菌株在Bacillus subtilis平板上出現(xiàn)了透明圈，直徑大約1 cm。因此，放線菌CT-1菌株產(chǎn)生的活性產(chǎn)物能夠抑制Bacillus subtilis（見圖3）。

3 結(jié) 論

從塔縣土壤中分離得到8株放線菌，其中CT -1產(chǎn)生的活性物質(zhì)能夠抑制Bacillus subtilis。從8株放線菌選出3株16S rRNA的序列分析，推斷放線菌CT-1，CT-3和CT-7菌株同屬于內(nèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。實驗表明，這3株放線菌雖然來源相同卻有不同的生理生化特性。

圖2 分離放線菌CT-1，CT-3和CT-7菌株的系統(tǒng)進化樹

圖3 8株放線菌對枯草芽孢桿菌的抑菌作用

［1］楊宇容，徐麗華.放線菌分離方法的研究［J］.微生物學通報，1995，22（2）：88-91.

［2］姜成林.放線菌分類學［M］.昆明：云南大學出版社，1995：3 -24.

［3］常顯波.不同環(huán)境海洋放線菌多樣性研究及2株放線菌新菌的分類鑒定［D］.中國海洋大學，2011：4-12.

［4］趙邑塵，薛泉宏，白霜，等.青海高寒地區(qū)油菜地土壤中放線菌組成及拮抗性放線菌研究［J］.西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2009，7：176-182.

［5］江紅，林如，陳路劼，等.智利海洋沉積物中放線菌多樣性［J］.微生物學報，2010，30（7）：862-869.

［6］夏占峰，關統(tǒng)偉，阮繼生，等.艾丁湖沉積物放線菌多樣性［J］.微生物學報，2011，51（8）：1023-1030.

［7］Xingxing Peng，Zaili Zhang，Ziling Zhao，et al.16S ribosomal DNA clone libraries to reveal bacterial diversity in anaerobic reactor-degraded tetrabromobisphenol A［J］.Bioresource Technology，2012，112（5）：75-82.

［8］Michal Letek，María Fiuza，Almudena F，et al.Cytoskeletal Proteins of Actinobacteria［J］.International Journal of Cell Biology，2012，2：1-10.

［9］Zhitang Lu，Weiwei Zhang.Comparative Phylogenies of Ribosomal Proteins and the 16S rRNA Gene at Higher Ranks of the Class Actinobacteria［J］.Currrent Microbiology，2012，4：1-6.

［10］東秀株，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［11］沈萍，陳向東.微生物學實驗［M］.北京：高等教育出版社，2008：85-88.

［12］Zhou JZ，Bruns MA，Tiedje JM.DNA recovery from soils of diverse composition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62（2）：316-322.

Isolation and Identification of a Strain of Actinomycetes Producing Bioactive Substance

ZHAN Jian-li，CHEN yun，CHEN Tao
（Department of Biological and Geographical Science，Kashi Normal College，Kashi844006，China）

Based on the analysis of16S rRNA sequence，this study isolated and identified actinomycetes isolated from the soil of Taxkorgan County.Then，by themethod of culturing on the plates，we analyzed and studied the active substance of the isolated actinomycetes.It is shown that the three separated actinomycetes possibly belonged to the genus of Paenibacillus，and their physiological and biochemical charateristics are different.Meanwhile，the strains of actinomycetes CT-1 had the antibacterial effects on Bacillus subtilis.

actinomycetes resources of Taxkorgan County，16S rRNA gene，PCR，sequence alignment，evolutionary tree

Q936

A

1007-4260（2014）03-0106-03

時間：2014-9-15 16：07 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.13757/j.cnki.cn34-1150/n.2014.03.026.html

2013-12-21

新疆維吾爾自治區(qū)高校課題（XJEDU2011S38）資助。

詹建立，男，山東寧津人，理學碩士，喀什師范學院生物與地理科學系副教授，主要從事生物化學教學和微生物生態(tài)領域的研究。