高效液相色譜-熒光檢測(cè)畜禽糞污中四種氟喹諾酮類抗生素殘留

張敏 劉慶玉 敖永華

摘要：為了建立高效液相色譜－熒光測(cè)定畜禽糞污中氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留的分析方法，將畜禽糞便樣品經(jīng)乙腈超聲提取，再經(jīng)正己烷液－液萃取，并經(jīng)氮吹濃縮，乙腈與水混合溶解殘?jiān)?，過微孔濾膜，采用高效液相色譜－熒光檢測(cè)，以０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）為流動(dòng)相，于激發(fā)波長２８０ ｎｍ、發(fā)射波長４８０ ｎｍ處進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，畜禽糞污樣品中４種喹諾酮類抗生素的平均回收率為７７．８％～９８．２％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為３．５％～７．２％，檢測(cè)限為０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ。該方法簡便、快速，可滿足畜禽糞污中4種喹諾酮類獸藥殘留量的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：畜禽糞污；喹諾酮類抗生素；高效液相色譜法；熒光檢測(cè)

中圖分類號(hào)：Ｏ６５７．７＋２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）03－0602-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Kinds of Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ Ｆｅｃｅｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＺＨＡＮＧ Ｍｉｎ，ＬＩＵ Ｑｉｎｇ－ｙｕ，ＡＯ Ｙｏｎｇ－ｈｕａ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｄｏｕｂｌｅ ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎ－ｈｅｘａｎｅ． Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ ｗａｓ ｖａｐｏｒｉｚｅｄ ｂｙ nitrogen stream， ｆｏｕｒ ａｎａｌｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ high performance liquid chromatography-ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ２８０ ｎｍ ａｎｄ ４８０ ｎｍ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｕｓｉｎｇ ０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ｐＨ ３．０）／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ （９４／６，Ｖ／Ｖ） ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｏｔｃｋ ｆｅｃｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ７７．８％ ｔｏ ９８．２％， and ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ were ３．５％～７．２％． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ０．００５ ｔｏ ０．０１0 μｇ／ｋｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｕｌｔｉｒｅｓｉｄｕｅｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｅａｓｙ ａｎｄ ｆａｓｔ． Ｉｔ ｈａｓ ａｌｓｏ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ four kinds of ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｆｅｃｅｓ； ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ； ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔ

近年來，隨著集約化畜牧業(yè)以及配合飼料工業(yè)的發(fā)展，抗生素作為飼料添加劑等越來越被廣泛地應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。獸用藥物在保障動(dòng)物健康、提高畜禽生產(chǎn)力和改善人民生活水平等方面都起著重要的作用，獸用藥物的種類及用量與日俱增，盡管抗生素作為獸藥和飼料添加劑在畜禽疾病防治和生長促進(jìn)方面發(fā)揮了較大的作用，然而，抗生素通過口服或肌肉注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，僅少量被內(nèi)臟器官吸收利用，約３０％～９０％以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動(dòng)物的糞便和尿液進(jìn)入生態(tài)環(huán)境中，給環(huán)境土壤、表層水體等生態(tài)環(huán)境帶來不良影響［１］。目前，畜禽養(yǎng)殖糞便及其施肥土壤中的獸用抗生素污染已經(jīng)達(dá)到較為嚴(yán)重的程度，畜禽糞便中抗生素帶來的環(huán)境污染問題引起了各方面的關(guān)注和重視［２］。

喹諾酮類藥物是最近２０年來迅速發(fā)展起來的一類十分重要的廣譜抗生素，是繼磺胺類藥物之后人類在合成抗生素方面最重要的突破，其抗菌作用是磺胺類藥物的近千倍。氟喹諾酮（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ，ＦＱｓ）類藥物是第三代喹諾酮類藥物，廣泛地用于畜禽的細(xì)菌、霉形體病防治，已投入使用或即將進(jìn)人獸醫(yī)領(lǐng)域的藥物有１０多種，目前國內(nèi)外已批準(zhǔn)用于動(dòng)物的ＦＱｓ包括恩諾沙星（Ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＥＮＲ）、諾氟沙星（Ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ，ＮＯＲ）、環(huán)丙沙星（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＣＩＰ）、氧氟沙星（Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＯＦＬ）等［３］。

近年來，氟喹諾酮類抗生素已在水環(huán)境、土壤環(huán)境和畜禽廢物中有不同程度的檢出［４－８］。對(duì)水環(huán)境、土壤、肉、奶、蛋等中氟喹諾酮類抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)的研究較多，主要是采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用方法，但利用高效液相色譜儀分析畜禽糞便中氟喹諾酮類抗生素的報(bào)道很少。為此，本研究建立了高效液相色譜－熒光檢測(cè)同時(shí)測(cè)定土壤中４種氟喹諾酮類抗生素的分析方法，旨為畜禽糞便中抗生素獸藥殘留提供技術(shù)支持。

１材料與方法

１．１儀器與試劑

Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器），Ｍｉｌｌｉｏｎ－Ｑ超純水制備系統(tǒng)，超聲波清洗器，旋渦混合器，離心機(jī)，精密ｐＨ計(jì)，氮吹儀等。

４種氟喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：氧氟沙星（ＯＦＬ）、諾氟沙星（ＮＯＲ）、環(huán)丙沙星（ＣＩＰ）和恩諾沙星（ＥＮＲ），純度＞９９．０％，Ｓｉｇｍａ公司。甲醇和乙腈，色譜純，Ｆｉｓｈｅｒ公司；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１糞尿樣品的前處理

1）畜禽糞便：準(zhǔn)確稱取待測(cè)雞或豬糞便１０.00 ｇ，置于５０ ｍＬ離心管中，加２０ ｍＬ乙腈和２ ｇ無水硫酸鈉浸泡提取，在漩渦混勻器上以２ ５００ ｒ／ｍｉｎ混勻１ ｍｉｎ，４５ ℃超聲２５ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將上清液轉(zhuǎn)入濃縮瓶中，再重復(fù)提取兩次，合并上清液，樣品上層清液用４０ ｍＬ正己烷萃取兩次，氮?dú)獯抵两?，用?ｍＬ乙腈飽和的正己烷溶解殘余物，轉(zhuǎn)入１０ ｍＬ離心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去正己烷層，下層清液用尼龍微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測(cè)定。

2）畜禽尿液及養(yǎng)殖廢水：取畜禽尿液及養(yǎng)殖廢水３０ ｍＬ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將上層清液用４０ ｍＬ正己烷萃取兩次，氮?dú)獯抵两?，用?ｍＬ乙腈飽和的正己烷溶解殘余物，轉(zhuǎn)入１０ ｍＬ離心管中，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去正己烷層，下層清液用尼龍微孔濾膜過濾，供高效液相色譜儀測(cè)定。

１．２．２色譜條件Ｗａｔｅｒｓ色譜柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；激發(fā)波長為２８０ ｎｍ，發(fā)射波長為４８０ ｎｍ；柱溫為４０ ℃；進(jìn)樣量為１０ μＬ；流動(dòng)相為０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺（ｐＨ３．０）／乙腈（９４／６，Ｖ／Ｖ）；流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．２．３標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精確稱?。埃埃保?０ ｇ氟喹諾酮類抗生素于１００ ｍＬ容量瓶中，再加入１０ ｍＬ ０．０３ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉進(jìn)行溶解，用乙腈定容至刻度，搖勻，得１００ μｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，依次得０．０１、０．０２、０．０５、０．１０、０．２０、０．５０、１．００ μｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，以色譜峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，得出氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星四種氟喹諾酮類抗生素獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

２結(jié)果與分析

２．１色譜條件的選擇

２．１．１流動(dòng)相的選擇氟喹諾酮類藥物屬兩性化合物，具有兩性官能基團(tuán)，在水溶液中均以離子形式存在，在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑可以降低其極性以改善峰形和提高分離度。研究過程中分別以不同離子對(duì)試劑為流動(dòng)相考察對(duì)氟喹諾酮分離的影響。試驗(yàn)確定了０．０１ ｍｏｌ／Ｌ四丁基溴化胺與乙腈（９４／６， Ｖ／Ｖ）溶液為流動(dòng)相，可獲得４種喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離圖（圖１），２5 ｍｉｎ內(nèi)均能達(dá)到基線分離。

２．１．２檢測(cè)波長的確定氟喹諾酮類藥物含苯環(huán)結(jié)構(gòu)和共軛大π鍵，因此有較高的熒光效率，可采用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。采用熒光檢測(cè)比紫外檢測(cè)高１～２個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)４種氟喹諾酮類藥物分別進(jìn)行激發(fā)－發(fā)射波長掃描，結(jié)合其最大吸收波長，實(shí)驗(yàn)確定了激發(fā)波長為２８０ ｎｍ和發(fā)射波長為４８０ ｎｍ為熒光檢測(cè)條件。

２．２線性關(guān)系和檢出限

在選定的色譜條件下，取不同濃度的４種氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)混合溶液分別進(jìn)樣，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，４種氟喹諾酮類藥物在０．０1～１．００ μｇ／ｍＬ范圍內(nèi)，濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以滿足定量分析的需要，其線性范圍見表１。以信噪比（Ｓ／Ｎ）為３計(jì)算方法的檢出限（ＬＯＤ），對(duì)氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測(cè)限分別為：０．０１0、０．００５、０．０１0和０．０１0 μｇ／kg。

２．３回收率和精密度

配制不同濃度的混合標(biāo)樣，分別對(duì)畜禽糞污樣品和空白樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。４種氟喹諾酮類藥物的添加回收率均在７７．８％～９８．２％之間，其多次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在３．５％～７．２％之間，該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好，能滿足畜禽糞便中氟喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)。回收率和方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表２，空白譜圖和添加濃度０．０1 ｍｇ／ｋｇ的色譜圖見圖２和圖３。

３結(jié)論

運(yùn)用所建立的方法對(duì)４種氟喹諾酮類藥物在各基質(zhì)中進(jìn)行檢測(cè)，平均回收率在７７．８％～９８．２％之間， 檢測(cè)限為０．００５～０．０１0 μｇ／ｋｇ，測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在３．５％～７．２％之間，且各藥物濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明方法的準(zhǔn)確性、精密度和靈敏度均符合殘留分析要求。所建立的方法操作簡便、靈敏度高，適用于畜禽糞污中４種氟喹諾酮類藥物殘留的同時(shí)測(cè)定。

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（責(zé)任編輯胡西洲）

收稿日期：２０１１－０８－０１

基金項(xiàng)目：沈陽市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（Ｆ１０－２３２－４－００）

作者簡介：張敏（１９７８－），女，遼寧朝陽人，講師，博士，主要從事農(nóng)業(yè)污染治理和資源化利用教學(xué)和科研工作，（電話）１３６１４０２０８０６（電子信箱）

ｍｉｎｚｈａｎｇ４１２＠１６３．ｃｏｍ；通訊作者，劉慶玉，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)業(yè)生物環(huán)境與能源利用教學(xué)和科研工作，

（電子信箱）ｑｙｌｉｕ＠１２６．ｃｏｍ。