孢子型乳酸菌對(duì)常用抗生素耐藥性及最低抑菌濃度測(cè)定

曾衛(wèi)軍,李杰

摘要：利用ＭＲＳ選擇性培養(yǎng)基，從商業(yè)產(chǎn)品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌。通過(guò)藥敏紙片法測(cè)定其在體外對(duì)臨床常用抗生素的敏感性及對(duì)飼料常用添加抗生素的ＭＩＣ值，以指導(dǎo)臨床用藥及飼料藥物添加，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒抽提研究。結(jié)果表明，該菌株對(duì)于多種臨床常用抗生素較為敏感，致使這些抗生素與該產(chǎn)品不能同時(shí)使用，大大降低了臨床抗生素的使用范圍。但質(zhì)粒抽提結(jié)果表明，該菌株不含有任何耐藥性質(zhì)粒，即該菌株用于益生保健產(chǎn)品的開發(fā)，具有分子生物學(xué)參考意義。

關(guān)鍵詞：孢子型乳酸菌；藥敏試驗(yàn)；ＭＩＣ值；質(zhì)粒

中圖分類號(hào)：Ｓ８５４．５＋２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：１００７－２７３Ｘ（２０12）03-0018-02

倍建素是由湖南普菲克生物科技有限公司開發(fā)的一種微生態(tài)制劑，其主要成分是孢子型乳酸菌（Ｂａｃｉｌｌuｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，８０億ＣＦＵ／ｇ），是集乳酸菌和芽孢菌的雙重優(yōu)勢(shì)的益生菌產(chǎn)品。研究表明，乳酸菌對(duì)于多數(shù)腸道菌如大腸桿菌、沙門氏菌等所引起的動(dòng)物腹瀉有較好的預(yù)防和保護(hù)作用［１，２］。目前臨床上對(duì)于抗生素的使用還十分廣泛［３］，為了防止臨床所用抗生素對(duì)孢子型乳酸菌產(chǎn)生抑制作用，對(duì)該菌的耐藥性進(jìn)行分析，對(duì)臨床抗生素的使用具有十分重要的指導(dǎo)意義。另一方面，隨著分子生物學(xué)的不斷深入，證實(shí)許多細(xì)菌攜帶有耐藥性質(zhì)粒［４］。而這些質(zhì)粒在細(xì)菌與細(xì)菌之間通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式，傳播到其他細(xì)菌中，導(dǎo)致受體菌產(chǎn)生耐藥性［５］。因此，了解該細(xì)菌是否攜帶有耐藥性質(zhì)粒，對(duì)于預(yù)防耐藥性的傳播具有舉足輕重的作用。本試驗(yàn)采用ＭＲＳ選擇培養(yǎng)基從產(chǎn)品中分離出乳酸桿菌，采用藥敏紙片法檢測(cè)其對(duì)臨床常用抗生素的耐藥性，進(jìn)而分析該菌攜帶質(zhì)粒的情況，一方面指導(dǎo)臨床用藥，另一方面可以確定該菌用于益生保健產(chǎn)品中的合理性。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

１．１．１指示菌大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ＡＴＣＣ３５２１８），金黃色葡萄球菌（Ａｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ａｕｒｅａｓ；ＡＴＣＣ２９２１３），糞腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ；ＡＴＣＣ２９２１２）。

１．１．２試驗(yàn)樣品來(lái)源倍健素（孢子型乳酸菌）購(gòu)自湖南普菲克生物科技有限公司。

１．１．３藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

１．１．４其他藥品由市場(chǎng)購(gòu)買。

１．１．５培養(yǎng)基乳酸菌分離培養(yǎng)用ＭＲＳ液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基。指示菌培養(yǎng)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通肉湯。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１乳酸菌的分離將樣品無(wú)菌取出１ｇ，用無(wú)菌水稀釋后接種于ＭＲＳ液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌富集培養(yǎng)２４ｈ。然后劃線于ＭＲＳ固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)２４ｈ后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，以獲得純菌。

１．２．２藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ＮＣＣＬＳ）標(biāo)準(zhǔn)２００５版的規(guī)定，采用藥敏紙片進(jìn)行耐藥性測(cè)定。用牙簽無(wú)菌蘸取純培養(yǎng)物菌液，均勻地涂布于整個(gè)平板表面，放置約１０～１５ｍｉｎ，待表面干燥后貼上藥敏紙片，于３７℃培養(yǎng)２４ｈ后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

１．２．３飼料中常用抗生素ＭＩＣ值的測(cè)定采用微量肉湯稀釋法，連續(xù)倍比稀釋，再每管加菌液０．１ｍＬ，第１至６孔藥物濃度最終分別為２５６、１２８、６４、３２、１６、８μｇ／ｍＬ。其中，第７孔為不含藥物的空白對(duì)照。將接種好的試管密封，置３７℃恒溫箱中孵育１６～２０ｈ，觀察結(jié)果。

１．２．４質(zhì)粒提取參照文獻(xiàn)［６］進(jìn)行操作。

２結(jié)果

２．１藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)藥敏紙片法對(duì)乙酰甲喹（痢菌凈）、呋喃唑酮（痢特靈）、利巴韋林（病毒唑）、芬苯達(dá)唑、泰妙菌素、復(fù)方新諾明（磺胺類）、頭孢哌酮、青霉素Ｇ、多粘菌素Ｂ、慶大霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等１４種抗生素進(jìn)行耐藥性測(cè)定，結(jié)果見表１。結(jié)果顯示，孢子型乳酸菌對(duì)于頭孢哌酮、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星都是極敏感，而只有對(duì)利巴韋林、芬苯達(dá)唑、乙酰甲喹、泰妙菌素為不敏感，這顯示在臨床用藥時(shí)，應(yīng)注意在使用孢子型乳酸菌的同時(shí)，應(yīng)避開頭孢哌酮、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星等極敏感藥物，同時(shí)應(yīng)避免同時(shí)使用慶大霉素、呋喃唑酮、鏈霉素等高敏感藥物，以防止這些藥物致使孢子型乳酸菌不能達(dá)到其預(yù)期的預(yù)防保護(hù)效果。為了確保該產(chǎn)品的效果，應(yīng)盡量使用利巴韋林、芬苯達(dá)唑、乙酰甲喹、泰妙菌素等不敏感藥物，在不與其他致病菌耐藥情況相沖突的情況下亦可考慮使用多粘菌素Ｂ、青霉素Ｇ等中敏感藥物。

２．２ＭＩＣ值測(cè)定結(jié)果

通過(guò)肉湯稀釋法，對(duì)飼料藥物添加劑金霉素、硫酸粘桿菌素Ｅ（抗敵素）、吉他霉素、喹乙醇、喹烯酮、土霉素、鹽霉素、新霉素、桿菌肽鋅、那西肽、維吉尼霉素（速大肥）、黃霉素、恩拉霉素、地克珠利等１４種抗生素的ＭＩＣ值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表２。由表2可見，該菌對(duì)喹乙醇十分敏感，在３２μｇ／ｍＬ的藥物濃度下就不能生長(zhǎng)，其次是土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ），金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）。而孢子型乳酸菌對(duì)于其他藥物皆不敏感，其ＭＩＣ值皆大于２５６μｇ／ｍＬ。

２．３質(zhì)粒提取結(jié)果

在細(xì)菌純化過(guò)程中，挑?。保爸陠蝹€(gè)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后進(jìn)行質(zhì)粒攜帶情況分析。分析結(jié)果表明，該細(xì)菌不存在質(zhì)粒，即該細(xì)菌不攜帶耐藥性質(zhì)粒，沒有傳播耐藥性的潛在可能性。因此該細(xì)菌用于益生保健產(chǎn)品具有分子生物學(xué)參考意義。

３討論

本試驗(yàn)從商業(yè)產(chǎn)品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌，通過(guò)藥敏紙片法測(cè)得該菌對(duì)頭孢哌酮等３５．７％的已檢藥物為極度敏感，對(duì)慶大霉素等２１．４％的已檢藥物為高度敏感，對(duì)于多粘菌素Ｂ等１４．３％的已檢藥物為中度敏感，對(duì)于利巴韋林等２８．６％的已檢藥物不敏感。指示臨床在運(yùn)用孢子型乳酸菌的同時(shí)運(yùn)用抗生素藥物防治其他細(xì)菌性疾病時(shí)，在不與其他致病菌耐藥性相沖突的前提下，只有２８．６％的藥物可用。若用其他本試驗(yàn)已測(cè)藥品進(jìn)行預(yù)防或冶療時(shí)，或可以將倍健素產(chǎn)品中的主要成分孢子型乳酸菌殺死，而達(dá)不到應(yīng)用微生態(tài)產(chǎn)品的預(yù)期保健目的。對(duì)于飼料藥物添加劑的ＭＩＣ值測(cè)定結(jié)果表明，喹乙醇（ＭＩＣ＝３２μｇ／ｍＬ）、土霉素（ＭＩＣ＝６４μｇ／ｍＬ）、金霉素（ＭＩＣ＝２５６μｇ／ｍＬ）等部分藥物在較低濃度即可以抑制孢子型乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)加以注意。質(zhì)粒提取試驗(yàn)表明，倍健素產(chǎn)品中的孢子型乳酸菌不攜帶任何質(zhì)粒，亦即表明孢子型乳酸菌中不含有任何耐藥性質(zhì)粒。將孢子型乳酸菌應(yīng)用于益生保健產(chǎn)品，沒有耐藥性質(zhì)粒轉(zhuǎn)接和傳播的潛在可能，具有分子生物學(xué)參考意義。

乳酸菌為兼性厭氧菌，在其生長(zhǎng)過(guò)程中可消耗腸道內(nèi)游離的氧，同時(shí)可以定殖于腸道，從而發(fā)揮菌膜屏障和化學(xué)屏障的作用；同時(shí)又可以產(chǎn)生有利于消化的酶、酸，從而達(dá)到保護(hù)腸道的目的［７，８］。隨著國(guó)內(nèi)臨床觀念由“冶”向“防”的轉(zhuǎn)變，像倍健素這樣的產(chǎn)品將會(huì)越來(lái)越受到養(yǎng)殖業(yè)的青睞，具有廣闊的發(fā)展前景。

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