曾衛(wèi)軍,李杰
摘要:利用MRS選擇性培養(yǎng)基,從商業(yè)產(chǎn)品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌。通過(guò)藥敏紙片法測(cè)定其在體外對(duì)臨床常用抗生素的敏感性及對(duì)飼料常用添加抗生素的MIC值,以指導(dǎo)臨床用藥及飼料藥物添加,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒抽提研究。結(jié)果表明,該菌株對(duì)于多種臨床常用抗生素較為敏感,致使這些抗生素與該產(chǎn)品不能同時(shí)使用,大大降低了臨床抗生素的使用范圍。但質(zhì)粒抽提結(jié)果表明,該菌株不含有任何耐藥性質(zhì)粒,即該菌株用于益生保健產(chǎn)品的開發(fā),具有分子生物學(xué)參考意義。
關(guān)鍵詞:孢子型乳酸菌;藥敏試驗(yàn);MIC值;質(zhì)粒
中圖分類號(hào):S854.5+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):1007-273X(2012)03-0018-02
倍建素是由湖南普菲克生物科技有限公司開發(fā)的一種微生態(tài)制劑,其主要成分是孢子型乳酸菌(Bacillus coagulans,80億CFU/g),是集乳酸菌和芽孢菌的雙重優(yōu)勢(shì)的益生菌產(chǎn)品。研究表明,乳酸菌對(duì)于多數(shù)腸道菌如大腸桿菌、沙門氏菌等所引起的動(dòng)物腹瀉有較好的預(yù)防和保護(hù)作用[1,2]。目前臨床上對(duì)于抗生素的使用還十分廣泛[3],為了防止臨床所用抗生素對(duì)孢子型乳酸菌產(chǎn)生抑制作用,對(duì)該菌的耐藥性進(jìn)行分析,對(duì)臨床抗生素的使用具有十分重要的指導(dǎo)意義。另一方面,隨著分子生物學(xué)的不斷深入,證實(shí)許多細(xì)菌攜帶有耐藥性質(zhì)粒[4]。而這些質(zhì)粒在細(xì)菌與細(xì)菌之間通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式,傳播到其他細(xì)菌中,導(dǎo)致受體菌產(chǎn)生耐藥性[5]。因此,了解該細(xì)菌是否攜帶有耐藥性質(zhì)粒,對(duì)于預(yù)防耐藥性的傳播具有舉足輕重的作用。本試驗(yàn)采用MRS選擇培養(yǎng)基從產(chǎn)品中分離出乳酸桿菌,采用藥敏紙片法檢測(cè)其對(duì)臨床常用抗生素的耐藥性,進(jìn)而分析該菌攜帶質(zhì)粒的情況,一方面指導(dǎo)臨床用藥,另一方面可以確定該菌用于益生保健產(chǎn)品中的合理性。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1指示菌大腸桿菌(Escherichia coli;ATCC35218),金黃色葡萄球菌(Ataphylococcosis aureas;ATCC29213),糞腸球菌(Enterococcus faecalis;ATCC29212)。
1.1.2試驗(yàn)樣品來(lái)源倍健素(孢子型乳酸菌)購(gòu)自湖南普菲克生物科技有限公司。
1.1.3藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。
1.1.4其他藥品由市場(chǎng)購(gòu)買。
1.1.5培養(yǎng)基乳酸菌分離培養(yǎng)用MRS液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基。指示菌培養(yǎng)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通肉湯。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1乳酸菌的分離將樣品無(wú)菌取出1g,用無(wú)菌水稀釋后接種于MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌富集培養(yǎng)24h。然后劃線于MRS固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)24h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化,以獲得純菌。
1.2.2藥敏試驗(yàn)根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)2005版的規(guī)定,采用藥敏紙片進(jìn)行耐藥性測(cè)定。用牙簽無(wú)菌蘸取純培養(yǎng)物菌液,均勻地涂布于整個(gè)平板表面,放置約10~15min,待表面干燥后貼上藥敏紙片,于37℃培養(yǎng)24h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。
1.2.3飼料中常用抗生素MIC值的測(cè)定采用微量肉湯稀釋法,連續(xù)倍比稀釋,再每管加菌液0.1mL,第1至6孔藥物濃度最終分別為256、128、64、32、16、8μg/mL。其中,第7孔為不含藥物的空白對(duì)照。將接種好的試管密封,置37℃恒溫箱中孵育16~20h,觀察結(jié)果。
1.2.4質(zhì)粒提取參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行操作。
2結(jié)果
2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果
通過(guò)藥敏紙片法對(duì)乙酰甲喹(痢菌凈)、呋喃唑酮(痢特靈)、利巴韋林(病毒唑)、芬苯達(dá)唑、泰妙菌素、復(fù)方新諾明(磺胺類)、頭孢哌酮、青霉素G、多粘菌素B、慶大霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等14種抗生素進(jìn)行耐藥性測(cè)定,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,孢子型乳酸菌對(duì)于頭孢哌酮、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星都是極敏感,而只有對(duì)利巴韋林、芬苯達(dá)唑、乙酰甲喹、泰妙菌素為不敏感,這顯示在臨床用藥時(shí),應(yīng)注意在使用孢子型乳酸菌的同時(shí),應(yīng)避開頭孢哌酮、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、恩諾沙星等極敏感藥物,同時(shí)應(yīng)避免同時(shí)使用慶大霉素、呋喃唑酮、鏈霉素等高敏感藥物,以防止這些藥物致使孢子型乳酸菌不能達(dá)到其預(yù)期的預(yù)防保護(hù)效果。為了確保該產(chǎn)品的效果,應(yīng)盡量使用利巴韋林、芬苯達(dá)唑、乙酰甲喹、泰妙菌素等不敏感藥物,在不與其他致病菌耐藥情況相沖突的情況下亦可考慮使用多粘菌素B、青霉素G等中敏感藥物。
2.2MIC值測(cè)定結(jié)果
通過(guò)肉湯稀釋法,對(duì)飼料藥物添加劑金霉素、硫酸粘桿菌素E(抗敵素)、吉他霉素、喹乙醇、喹烯酮、土霉素、鹽霉素、新霉素、桿菌肽鋅、那西肽、維吉尼霉素(速大肥)、黃霉素、恩拉霉素、地克珠利等14種抗生素的MIC值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2。由表2可見,該菌對(duì)喹乙醇十分敏感,在32μg/mL的藥物濃度下就不能生長(zhǎng),其次是土霉素(MIC=64μg/mL),金霉素(MIC=256μg/mL)。而孢子型乳酸菌對(duì)于其他藥物皆不敏感,其MIC值皆大于256μg/mL。
2.3質(zhì)粒提取結(jié)果
在細(xì)菌純化過(guò)程中,挑?。保爸陠蝹€(gè)菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng),然后進(jìn)行質(zhì)粒攜帶情況分析。分析結(jié)果表明,該細(xì)菌不存在質(zhì)粒,即該細(xì)菌不攜帶耐藥性質(zhì)粒,沒有傳播耐藥性的潛在可能性。因此該細(xì)菌用于益生保健產(chǎn)品具有分子生物學(xué)參考意義。
3討論
本試驗(yàn)從商業(yè)產(chǎn)品倍健素中分離出其主要成分孢子型乳酸菌,通過(guò)藥敏紙片法測(cè)得該菌對(duì)頭孢哌酮等35.7%的已檢藥物為極度敏感,對(duì)慶大霉素等21.4%的已檢藥物為高度敏感,對(duì)于多粘菌素B等14.3%的已檢藥物為中度敏感,對(duì)于利巴韋林等28.6%的已檢藥物不敏感。指示臨床在運(yùn)用孢子型乳酸菌的同時(shí)運(yùn)用抗生素藥物防治其他細(xì)菌性疾病時(shí),在不與其他致病菌耐藥性相沖突的前提下,只有28.6%的藥物可用。若用其他本試驗(yàn)已測(cè)藥品進(jìn)行預(yù)防或冶療時(shí),或可以將倍健素產(chǎn)品中的主要成分孢子型乳酸菌殺死,而達(dá)不到應(yīng)用微生態(tài)產(chǎn)品的預(yù)期保健目的。對(duì)于飼料藥物添加劑的MIC值測(cè)定結(jié)果表明,喹乙醇(MIC=32μg/mL)、土霉素(MIC=64μg/mL)、金霉素(MIC=256μg/mL)等部分藥物在較低濃度即可以抑制孢子型乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖,應(yīng)加以注意。質(zhì)粒提取試驗(yàn)表明,倍健素產(chǎn)品中的孢子型乳酸菌不攜帶任何質(zhì)粒,亦即表明孢子型乳酸菌中不含有任何耐藥性質(zhì)粒。將孢子型乳酸菌應(yīng)用于益生保健產(chǎn)品,沒有耐藥性質(zhì)粒轉(zhuǎn)接和傳播的潛在可能,具有分子生物學(xué)參考意義。
乳酸菌為兼性厭氧菌,在其生長(zhǎng)過(guò)程中可消耗腸道內(nèi)游離的氧,同時(shí)可以定殖于腸道,從而發(fā)揮菌膜屏障和化學(xué)屏障的作用;同時(shí)又可以產(chǎn)生有利于消化的酶、酸,從而達(dá)到保護(hù)腸道的目的[7,8]。隨著國(guó)內(nèi)臨床觀念由“冶”向“防”的轉(zhuǎn)變,像倍健素這樣的產(chǎn)品將會(huì)越來(lái)越受到養(yǎng)殖業(yè)的青睞,具有廣闊的發(fā)展前景。
參考文獻(xiàn):
[1]李亞杰,趙獻(xiàn)軍.益生菌對(duì)腸道黏膜的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(7):38-41.
[2]趙玲艷,鄧放明,楊細(xì)平,等.生物防腐劑—乳酸菌素[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2005(2):27-29.
[3]藏金燦.細(xì)菌耐藥性機(jī)制與臨床合理用藥[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(5):1377-1379.
[4]張杰,王辰.肺部感染細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2002,12(1):79-80.
[5]LECLERCQ R,DERLOT E,DUVAL J,et al. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in enterococcus faecium[J]. The New England Journal of Medicine,1988,319(3):157-161.
[6]ANDERSON D G,MCKAY L L. Simple and rapid method for isolation large plasmid DNA from lactic streptococci[J]. Applied and Environmental Microbiology,1983,46(3):549-552.
[7]孟濤.乳酸菌及其生長(zhǎng)因子對(duì)人畜健康的作用[J].生物工程進(jìn)展,1993,13(4):48-52.
[8]黃紅,張伶俐,辛學(xué)瓊.淺談乳酸菌素的作用機(jī)理及應(yīng)用[J].職業(yè)衛(wèi)生與病傷,2004,3(19):229-230.