葡萄組織培養(yǎng)中愈傷組織的誘導(dǎo)

崔鵬

摘要：采用三因素（萘乙酸ＮＡＡ，吲哚丁酸ＩＢＡ，６－芐氨基嘌呤６－ＢＡ）四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)“鄞紅”葡萄近梢處的嫩莖段和幼果進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。結(jié)果表明，６－ＢＡ對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響最大。以嫩莖段為外植體的最佳培養(yǎng)基配方是ＭＳ＋1．00 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０.20 ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，其誘導(dǎo)率為７０．００％。以幼果為外植體的最佳培養(yǎng)基配方是ＭＳ＋０．８0 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２0 ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，誘導(dǎo)率為６１．８５％。嫩莖段是“鄞紅”葡萄愈傷組織誘導(dǎo)最理想的外植體。

關(guān)鍵詞：葡萄；嫩莖；幼果；愈傷組織誘導(dǎo)；正交設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ６６３．１；Ｑ８１３．１＋２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0827-03

葡萄是多年生落葉藤本漿果類(lèi)果樹(shù)，屬葡萄科（Ｖｉｔａｃｅａｃｅ）葡萄屬（Ｖｉｔｉｓ Ｌ．）植物［１］。其常規(guī)栽培繁殖方法為扦插和嫁接，長(zhǎng)期采用導(dǎo)致葡萄品種退化，病害感染率高，嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)［２，３］，而組織培養(yǎng)可以達(dá)到縮短育種周期、減輕病害和快速繁殖的目的［４］。葡萄葉片和葉柄再生比較困難［１］。李云等［５］對(duì)“紅地球”葡萄葉片及葉柄進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，石雪暉［６］對(duì)藤稔葡萄葉片、莖段、葉柄和卷須進(jìn)行離體培養(yǎng)，其誘導(dǎo)率和不定芽分化率均不高。試驗(yàn)所選材料為“鄞紅”葡萄，屬歐美雜種（Ｖ． ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．×Ｖ． ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．），在浙江省栽培范圍較廣，目前還鮮有關(guān)于此品種的組織培養(yǎng)研究報(bào)道。通過(guò)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素濃度配比，以期為該葡萄品種的組織培養(yǎng)和快速繁殖提供有效途徑和方法。

１材料與方法

１．１材料

材料取自寧波市江北綠艷果蔬專(zhuān)業(yè)合作社葡萄試驗(yàn)基地，以“鄞紅”葡萄的嫩莖段與幼果作為外植體。

１．２方法

１．２．１外植體消毒先用自來(lái)水洗去外植體表面殘留物質(zhì)，在洗潔精中浸泡１０ ｍｉｎ，再用自來(lái)水充分清洗，并用無(wú)菌水洗滌一次。然后在體積分?jǐn)?shù)為７０％的乙醇溶液中浸泡４０ ｓ，用無(wú)菌水沖洗２～３次，再用1 g/L的HgCl2對(duì)外植體處理７ ｍｉｎ，并用無(wú)菌水洗滌５～６次。將消毒處理的外植體放在事先滅好菌的濾紙上吸干表面水分，把消過(guò)毒的傷口剪掉，然后接種于培養(yǎng)瓶中。

１．２．２試驗(yàn)設(shè)計(jì)與培養(yǎng)條件于２００９年５月１６日對(duì)“鄞紅”葡萄近梢處的嫩莖段和幼果進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。以ＭＳ為基本培養(yǎng)基，附加２０ ｇ／Ｌ蔗糖，７ ｇ／Ｌ瓊脂，ｐＨ為５．８～６．０。采取三因素（萘乙酸ＮＡＡ，吲哚丁酸ＩＢＡ，６－芐氨基嘌呤６－ＢＡ）四水平的正交試驗(yàn)，即Ｌ１６（４３）正交設(shè)計(jì)（表１），進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)。每個(gè)處理接種２０瓶，每瓶６個(gè)外植體，重復(fù)３次。培養(yǎng)條件為溫度２５ ℃，光照時(shí)間１２ ｈ／ｄ，光照度２ ０００ ｌｘ，培養(yǎng)７周。

１．２．３統(tǒng)計(jì)方法接種后，每隔５～７ ｄ觀察記錄愈傷組織的生長(zhǎng)狀況，至２００９年７月１５日統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率、顏色和質(zhì)量。數(shù)據(jù)處理使用ＤＰＳ系統(tǒng)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)［７］。

２結(jié)果與分析

２．１不同激素配比對(duì)嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

６－ＢＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ對(duì)嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)影響的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表２。１６個(gè)處理中，Ｋ處理（ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ）的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到７０．００％。愈傷組織呈棕黃色，誘導(dǎo)速度比較快，且質(zhì)量致密（圖1）。其次為Ｈ處理（ＭＳ＋０．８０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ），誘導(dǎo)率達(dá)到６１．８８％，愈傷組織呈棕黃色，質(zhì)量也致密。而Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ處理沒(méi)有愈傷組織產(chǎn)生。由表３的方差分析可以看出，６－ＢＡ、ＮＡＡ和ＩＢＡ不同濃度水平對(duì)嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別達(dá)到顯著（Ｐ＜０．０５）或極顯著（Ｐ＜０．０１）差異。１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ水平下愈傷組織誘導(dǎo)率極顯著高于１．５０ ｍｇ／Ｌ水平，但與０．８０ ｍｇ／Ｌ水平無(wú)顯著性差異，表明６－ＢＡ濃度過(guò)高時(shí)不利于愈傷組織誘導(dǎo)。ＮＡＡ在０．１０ ｍｇ／Ｌ水平下愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到４４．４２％，極顯著高于０．０５ ｍｇ／Ｌ水平和對(duì)照0 ｍｇ／Ｌ水平，但與０．２０ ｍｇ／Ｌ水平無(wú)顯著性差異，表明ＮＡＡ濃度過(guò)低時(shí)不利于愈傷組織產(chǎn)生。ＩＢＡ在０．２０ ｍｇ／Ｌ或是０ ｍｇ／Ｌ水平下誘導(dǎo)率較高，分別為４４．４２％和４１．１０％，極顯著高于０．１０和０．０５ ｍｇ／Ｌ水平。

因素內(nèi)水平極差值的大小能夠說(shuō)明該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度。經(jīng)表３計(jì)算得知，６－ＢＡ對(duì)“鄞紅”葡萄近梢處的嫩莖段作用影響是最大的，極差為４７．９８，其次是ＮＡＡ和ＩＢＡ，極差均為２７．４９，即３個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響的主次關(guān)系為６－ＢＡ＞ＮＡＡ＝ＩＢＡ。嫩莖段愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ。

２．２不同激素配比對(duì)幼果愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表４可知，不同激素配比對(duì)幼果愈傷組織誘導(dǎo)的影響不同。Ｋ處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到６１．８５％，愈傷組織呈淺黃色，質(zhì)量致密（圖２）。其次是Ｊ處理，誘導(dǎo)率為６０．２９％，愈傷組織呈淡黃色。Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ處理則無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。經(jīng)表５的方差分析可知，６－ＢＡ、ＮＡＡ和ＩＢＡ不同濃度水平對(duì)幼果愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別達(dá)到顯著（Ｐ＜０．０５）或極顯著（Ｐ＜０．０１）差異。６－ＢＡ在０．８０ ｍｇ／Ｌ水平下愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為４８．６６％，顯著高于其他３個(gè)水平，表明６－ＢＡ濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于愈傷組織產(chǎn)生。ＮＡＡ在０．１０ ｍｇ／Ｌ水平下誘導(dǎo)率最高，為３７．６０％，其次是０．０５ ｍｇ／Ｌ水平，二者之間無(wú)顯著性差異。ＩＢＡ在0和０．０５ ｍｇ／Ｌ水平下愈傷組織誘導(dǎo)率較低，極顯著低于０．１０和０．２０ ｍｇ／Ｌ水平。同時(shí)，根據(jù)表５計(jì)算得知，６－ＢＡ對(duì)“鄞紅”葡萄近梢處幼果愈傷組織誘導(dǎo)率的影響作用是最大的，極差值為４８．６６，其次是ＮＡＡ和ＩＢＡ，極差值都是１４．８１，即３個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響的主次關(guān)系為６－ＢＡ＞ＮＡＡ＝ＩＢＡ。因此，幼果愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為Ｋ處理，即ＭＳ＋０．８０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ。

３討論

目前，國(guó)內(nèi)外已有利用葡萄葉片、莖尖和花藥［８］等組織器官為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)并獲得愈傷組織和芽苗的成功經(jīng)驗(yàn)，但幼果作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)還比較少。本試驗(yàn)選取了葡萄嫩莖段和幼果作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嫩莖段的誘導(dǎo)率高于幼果，且誘導(dǎo)時(shí)間短，愈傷組織質(zhì)量?jī)?yōu)于幼果，因此，對(duì)于該品種來(lái)說(shuō)，嫩莖段是其最理想的誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。值得注意的是，本試驗(yàn)所用嫩莖段是葉柄與莖的交接處，而非其他部位。

植物愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生受多種因素的影響，其中外植體類(lèi)型、激素種類(lèi)與濃度配比是其主要影響因素。如果生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例適中，對(duì)保持愈傷組織的快速生長(zhǎng)是非常有必要的［９］。試驗(yàn)中，６－ＢＡ對(duì)嫩莖段或幼果愈傷組織誘導(dǎo)均有最大影響，是必不可少的激素。不添加６－ＢＡ，則未能產(chǎn)生愈傷組織。另外，愈傷組織誘導(dǎo)需要６－ＢＡ和ＮＡＡ同時(shí)使用，這與宋英今等［１０］闡述的使用安祖花嫩莖誘導(dǎo)時(shí)，只有６－ＢＡ和ＮＡＡ的配合使用才有利于愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道相一致。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 張劍俠，王賀飛，徐炎，等． 中國(guó)野生葡萄組織培養(yǎng)研究［Ｊ］． 西北植物學(xué)報(bào)，２００３，２３（３）：４６０－４６１．

［２］ 張建華，莊天明，孫占剛，等． 華佳８號(hào)葡萄離體繁殖技術(shù)的研究［Ｊ］． 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），２００４，２２（３）：３０９－３１２．

［３］ 周鵬，郭安平，王躍進(jìn)，等． ２個(gè)葡萄品系外植體愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生［Ｊ］． 熱帶作物學(xué)報(bào)，２００２，２３（３）：５２－５７．

［４］ 師校欣，杜國(guó)強(qiáng)，賀柱，等． 外植體及培養(yǎng)條件對(duì)葡萄不定芽再生的影響［Ｊ］． 果樹(shù)學(xué)報(bào)，２００８，２５（４）：５８５－５８８．

［５］ 李云， 馮慧， 田硯亭． “紅地球”葡萄葉片、葉柄不定芽再生體系的建立［Ｊ］． 園藝學(xué)報(bào)，２００２，２９（１）：６０－６２．

［６］ 石雪暉． 藤稔葡萄離體培養(yǎng)研究［Ｊ］．葡萄栽培與釀酒，１９９５（１）：２７－３１．

［７］ 唐啟義，馮明光． 使用統(tǒng)計(jì)分析及其ＤＰＳ數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)［Ｍ］． 北京：科學(xué)出版社，２００２.４３－５０．

［８］ 高金輝，王玲，張厚良，等． 山葡萄組織培養(yǎng)方法［Ｊ］． 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００７，３５（７）：３７－３９．

［９］ 鞏振輝，申書(shū)興． 植物組織培養(yǎng)［Ｍ］． 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，２００７． ６８－６９．

［１０］ 宋英今，季靜，劉海學(xué)，等． 安祖花愈傷組織誘導(dǎo)及其分化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［Ｊ］． 核農(nóng)學(xué)報(bào)，２００８，２２（３）：３０２－３０３．