熒光定量PCR法檢測(cè)鄰苯二甲酸酯的研究

白舟等

摘要：建立了一種利用外切酶保護(hù)－熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)環(huán)境激素鄰苯二甲酸酯的方法。將從魚肝臟中提取含雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)，與不同濃度的鄰苯二甲酸酯結(jié)合，采用常規(guī)ＰＣＲ方法擴(kuò)增制備雙鏈結(jié)合ＤＮＡ，將其與配體－受體復(fù)合物反應(yīng)的結(jié)合物，用核酸外切酶ＥｘｏⅢ和Ｓ１核酸酶處理，消解游離ＤＮＡ，并以消解后產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)，建立Ｃｔ值與鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度Ｃ（ｇ／Ｌ）的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線：Ｃｔ＝－０．２７３ ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。將該方法應(yīng)用于水樣中鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到１０～１００ μｇ／ｍＬ。該法準(zhǔn)確度高、抗干擾性強(qiáng)、適用于檢測(cè)大批量環(huán)境樣品中鄰苯二甲酸酯。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯；熒光定量ＰＣＲ；核酸外切酶

中圖分類號(hào)：Ｘ８２６；Ｘ５６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0823-04

鄰苯二甲酸酯（Ｐｈｔｈａｌａｔｅｓ）是塑料的增塑劑，用于增大產(chǎn)品的可塑性和提高產(chǎn)品的強(qiáng)度［１］。隨著塑料工業(yè)的迅速發(fā)展和塑料制品的廣泛應(yīng)用，這類污染物已大量進(jìn)入環(huán)境，普遍存在于土壤、底泥、水體、生物、空氣及大氣降塵物等環(huán)境中［２，３］，對(duì)環(huán)境的不利影響也逐漸凸顯。研究表明，鄰苯二甲酸酯具有急性毒性、致癌性和致畸性等多種生物毒性［４－６］，而且鄰苯二甲酸酯水解和光解速率都非常緩慢，已成為一種全球性的環(huán)境有機(jī)污染物，被中國(guó)環(huán)境檢測(cè)總站和美國(guó)ＥＰＡ列為優(yōu)先控制污染物［７］。

目前，鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)方法包括：氣相色譜法［８］、液相色譜法［９］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（ＧＣ－ＭＳ）［１０］以及熒光法［１１］等。由于這類方法檢測(cè)成本高，操作復(fù)雜，分析時(shí)間長(zhǎng)，因此不利于對(duì)環(huán)境樣品的快速分析。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用具有高靈敏度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ＰＣＲ）檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)鄰苯二甲酸酯正逐漸受到關(guān)注。目前，ＰＣＲ技術(shù)主要用于檢測(cè)鄰苯二甲酸酯的雌激素效應(yīng)［１２－１５］，而直接用于檢測(cè)環(huán)境樣本中鄰苯二甲酸酯含量的研究報(bào)道較少。

鄰苯二甲酸酯作為雌激素受體的配體，能夠與雌激素受體結(jié)合并能誘導(dǎo)雌激素受體介導(dǎo)的基因表達(dá)，其作用過(guò)程為：鄰苯二甲酸酯與細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的雌激素受體結(jié)合，然后這種結(jié)合體遷移到細(xì)胞核并與核內(nèi)ＤＮＡ上雌激素反應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，上行調(diào)節(jié)雌激素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)入相應(yīng)的靶組織或靶器官，從而引起雌激素效應(yīng)［１６］。根據(jù)此原理，建立檢測(cè)鄰苯二甲酸酯的核酸外切酶保護(hù)－熒光定量ＰＣＲ分析方法。用鄰苯二甲酸酯誘導(dǎo)雌激素受體與特異性的雙鏈ＤＮＡ結(jié)合，游離的ＤＮＡ被Ｓ１核酸酶降解，以酶切產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)。由于傳統(tǒng)的酶切保護(hù)分析方法［１７］靈敏度低，假陽(yáng)性率高。本試驗(yàn)在傳統(tǒng)酶切保護(hù)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用Ｓ１核酸酶完全切除ＥｘｏⅢ酶切后留下的單鏈，使游離的ＤＮＡ不能被擴(kuò)增，并結(jié)合ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光定量ＰＣＲ技術(shù)對(duì)水樣中ＰＡＥｓ含量進(jìn)行檢測(cè)。

１材料與方法

１．１試劑

鄰苯二甲酸二甲酯，ＰＣＲ試劑盒，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ＰＣＲ ｍｉｘ，核酸外切酶ＥｘｏⅢ，Ｓ１核酸酶，其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器包括ＵＶ－２０００紫外分光光度計(jì)、Ｒｏｔｏｒ－ｇｅｎｅ ３０００熒光定量ＰＣＲ儀、ＤＹＹ－１１型電泳儀（北京市六一儀器廠）、Ｔａｎｏｎ－２５００Ｒ數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

１．２引物設(shè)計(jì)

利用ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)含有雌激素反應(yīng)位點(diǎn)的上下游引物，由上海英駿生物科技有限公司合成。引物序列如下：上游引物Ｒ１： ５′ＣＡＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＡＣ ＴＧ ３′；下游引物Ｒ２： ５′ＧＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＡＣ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＧ ３′。下劃線標(biāo)明了雌激素反應(yīng)位點(diǎn)，模板為稀釋５０倍后的ｐＵＣ１９質(zhì)粒［１８］。

１．３方法

１．３．１含有受體細(xì)胞溶質(zhì)的提取取體長(zhǎng)為１２ ｃｍ左右的鯉魚（２０尾），用含０．０５ ｍｇ／Ｌ的鄰苯二甲酸酯的水喂養(yǎng)兩周后，取魚肝臟，用冰上預(yù)冷的０．１５ ｍｏｌ／Ｌ氯化鉀溶液去除肝臟外血液后，吸干其表面水分，按照ｍ（肝臟，ｍｇ）∶ｖ（緩沖液，ｍＬ）＝１∶４的比例加入ＨＥＤＧ緩沖液（冰上預(yù)冷）后勻漿。勻漿液于１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１ ｈ，收集上清，即為含有雌激素受體的細(xì)胞溶質(zhì)，分裝后于－８０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．３．２ 結(jié)合ＤＮＡ的制備每５０ μＬ擴(kuò)增體系中包含：滅菌雙蒸水３６ μＬ、ｐＵＣ１９質(zhì)粒模板工作液２ μＬ、１０倍ＰＣＲ緩沖液５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ的四種核苷酸的混合物（ｄＮＴＰｓ）１ μＬ、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各２ μＬ、２ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶２ μＬ。常規(guī)ＰＣＲ循環(huán)步驟：預(yù)變性９４℃、５ ｍｉｎ；變性９４ ℃、３０ ｓ；退火５８ ℃、４０ ｓ；延伸７２ ℃、４０ ｓ；循環(huán)３０次，最終延伸７２ ℃、５ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１％的瓊脂糖凝膠電泳分離，用ＰＣＲ產(chǎn)物快速純化試劑盒純化回收。

１．３．３配體－受體－結(jié)合ＤＮＡ復(fù)合物的制備與酶切將１ ｇ／Ｌ的ＰＡＥｓ按１０倍比稀釋為1.0×１0-1 ｇ／Ｌ～1.0×１0-9 ｇ／Ｌ，各?。保唉蹋?，加入細(xì)胞溶質(zhì)２５０ μＬ，于２０ ℃振蕩溫育２ ｈ。加入０．２ ｍＬ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為６０％的羥基磷灰石（ＨＡＰ）混勻，冰?。常?ｍｉｎ， 在４℃以３ ５００ ｒ／ｍｉｍ離心１ ｍｉｎ，棄上清。上述沉淀中加入１ ｍＬ含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為０．０５％ Ｔ－８０的ＨＥＤＧ緩沖液，同條件離心１５ ｍｉｎ，重復(fù)３次，最后1次棄上清，加入０．２ ｍｏｌ／Ｌ的磷酸緩沖液０．４ ｍＬ，間歇振蕩３次，離心１５ ｍｉｎ，取上清，即為配體－受體復(fù)合物。

從上述不同濃度配體－受體復(fù)合物中，每管取出２０ μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ結(jié)合ＤＮＡ，繼續(xù)２０℃溫育１５ ｍｉｎ，此時(shí)溶液中為配體－受體－結(jié)合ＤＮＡ復(fù)合物。

酶切步驟：從上述配體－受體－結(jié)合ＤＮＡ復(fù)合物中各?。保?μＬ于１．５ ｍＬ小管中，加入２ μＬ ＥｘｏⅢ核酸外切酶緩沖液，６ μＬ Ｈｅｐｅｓ緩沖液，使總體積為２０ μＬ，混勻后３７℃溫育１５ ｍｉｎ；每管再加入ＥｘｏⅢ １００ Ｕ，混勻后于３７℃溫育１５ ｍｉｎ；按照體積比為１∶３的比例，加入Ｓ１核酸酶（２ Ｕ／μＬ）混合液，３７℃溫育３０ ｍｉｎ；再各加入４ μＬ Ｓ１核酸酶終止液，７０℃滅活１０ ｍｉｎ，得到熒光定量ＰＣＲ的模板。

１．４熒光定量ＰＣＲ條件

每２０ μＬ體系中包含ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １０ μＬ（ＭｇＣｌ２最佳質(zhì)量濃度為２ μｍｏｌ／Ｌ）、上下游引物（１０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ、配體－受體結(jié)合ＤＮＡ復(fù)合物酶切產(chǎn)物作為模板２．５ μＬ、滅菌雙蒸水５．５ μＬ。熒光定量ＰＣＲ循環(huán)步驟：９４ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ，９４ ℃變性３０ ｓ，５８℃退火４０ ｓ，７２℃延伸１ ｍｉｎ，循環(huán)４０次，最后在７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。

２結(jié)果與分析

２．１結(jié)合ＤＮＡ的凝膠電泳分析

常規(guī)ＰＣＲ擴(kuò)增后產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為１％的瓊脂糖凝膠電泳分析（圖１）。結(jié)合ＤＮＡ為長(zhǎng)度１ ０２４ ｂｐ的雙鏈ＤＮＡ，與設(shè)計(jì)的雙鏈ＤＮＡ長(zhǎng)度相符。用ＰＣＲ產(chǎn)物快速純化試劑盒純化回收后，用紫外分光光度法測(cè)得ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ值為１．８６，表明回收ＤＮＡ純度高。

２．２配體－受體復(fù)合物的ＳＰＲ鑒定

表面等離子體共振（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）技術(shù)具有免標(biāo)記、實(shí)時(shí)在線檢測(cè)、高靈敏度、非破壞性及高選擇性等優(yōu)點(diǎn)［１８］。本試驗(yàn)采用ＳＰＲ定性鑒定雌激素受體蛋白與鄰苯二甲酸酯結(jié)合情況（圖２、３）。

隨著復(fù)合物中加入鄰苯二甲酸酯配體濃度的增加，配體－受體復(fù)合物的ＳＰＲ響應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)。在加入鄰苯二甲酸酯濃度在1.0×10-9～１.0 ｇ／Ｌ范圍內(nèi)，鄰苯二甲酸酯配體濃度與受體－配體復(fù)合物的ＳＰＲ響應(yīng)強(qiáng)度之間基本呈線性關(guān)系。說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，加入含雌激素受體的細(xì)胞質(zhì)為２５０ μＬ時(shí)，鄰苯二甲酸酯可與雌激素受體結(jié)合。

２．３不同濃度鄰苯二甲酸酯誘導(dǎo)結(jié)合ＤＮＡ的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ熒光定量ＰＣＲ

以不同濃度的鄰苯二甲酸酯制備的配體－受體－結(jié)合ＤＮＡ復(fù)合物，經(jīng)過(guò)外切酶保護(hù)處理，作為熒光定量ＰＣＲ模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線見圖４和圖５。鄰苯二甲酸酯配體質(zhì)量濃度Ｃ（ｇ／Ｌ）對(duì)數(shù)與Ｃｔ值具有線性關(guān)系，兩者關(guān)系式為Ｃｔ＝－０．２７３*ｌｏｇ（Ｃ）＋６．３２０，Ｒ２＝０．９９４ ８，本方法對(duì)鄰苯二甲酸酯的檢出限為１０－１０ ｇ／Ｌ，在低濃度水平下，Ｃｔ并未出現(xiàn)顯著變化。

本試驗(yàn)的受試水樣來(lái)源于松江東華大學(xué)北側(cè)的張家浜河河水，樣本經(jīng)過(guò)預(yù)處理后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖６所示，其線性檢測(cè)范圍為１０～１００ μｇ／ｍＬ。

２．４特異性分析

將多氯聯(lián)苯和雙酚Ａ代替鄰苯二甲酸酯后，按１．４中所述方法進(jìn)行熒光定量ＰＣＲ擴(kuò)增，未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，表明多氯聯(lián)苯和雙酚Ａ并沒有與受體結(jié)合，而鄰苯二甲酸酯能與受體結(jié)合，說(shuō)明此方法特異性較好。

２．５加標(biāo)回收分析

用不含鄰苯二甲酸酯的水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。加標(biāo)回收結(jié)果見表１。由結(jié)果可知，回收率為８１．６％～９７．６％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為２．６９％～４．４５％。由表１可以看出，本文建立的外切酶保護(hù)－熒光定量ＰＣＲ方法準(zhǔn)確度高，可以較好地應(yīng)用于環(huán)境中鄰苯二甲酸酯的檢測(cè)。

３結(jié)論

建立了一種利用外切酶保護(hù)－熒光定量ＰＣＲ檢測(cè)方法，用Ｓ１核酸酶完全切除核酸外切酶ＥｘｏⅢ酶切后留下的單鏈，使游離ＤＮＡ完全不能被ＰＣＲ擴(kuò)增出來(lái)，提高了靈敏度。以配體－受體－ＤＮＡ復(fù)合物為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，當(dāng)配體－受體－ＤＮＡ復(fù)合物中加入的鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度在１０－９～１０－１ ｇ／Ｌ范圍內(nèi)時(shí)，鄰苯二甲酸酯對(duì)數(shù)濃度與Ｃｔ值線性關(guān)系為Ｃｔ＝－０．２７３ｌｇ（Ｃ）＋６．３２０。水樣樣本的檢測(cè)范圍達(dá)１０～１００ μｇ／ｍＬ。該方法可同時(shí)處理多個(gè)樣品，且靈敏度高，準(zhǔn)確性好，抗干擾性強(qiáng)，檢測(cè)過(guò)程僅２~３ ｈ，為高通量快速檢測(cè)環(huán)境樣品中的鄰苯二甲酸酯提供了新方法。