酸櫻桃中原花青素的分離與純化

張卓睿等

摘要：以ＮＫＡ樹脂為吸附劑，對(duì)酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）中原花青素的分離純化進(jìn)行了研究。通過單因素試驗(yàn)分析確定了原花青素分離純化的最佳工藝條件為，上樣濃度７ ｍｇ／Ｌ，上樣流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液作為洗脫劑，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速進(jìn)行洗脫。經(jīng)樹脂純化后的原花青素通過ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析確定其主要含兩種組分，分別為原花青素－３－葡萄糖苷和（－）－表兒茶素沒食子酸酯。

關(guān)鍵詞：酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）；原花青素；ＮＫＡ樹脂；分離；純化

中圖分類號(hào)：Ｑ９４９．７５１．８；ＴＱ９１４．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）04－0800-04

酸櫻桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）屬薔薇科李屬（Ｐｒｕｎｕｓ Ｌ．）經(jīng)濟(jì)樹木，其果實(shí)中含有豐富的原花青素［１－３］。原花青素（Ｐｒｏｃｙｎｉｄｉｎｓ，簡稱ＰＣ）是一大類多酚類化合物的總稱，是由兒茶素、表兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯通過Ｃ４－Ｃ６或Ｃ４－Ｃ８連接而成的不同聚合度的混合物［４］。

原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯地抑菌、消炎、抗癌、抗老化和抑制膽固醇上升等功效，攝取一定量原花青素能夠有效地預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生［５－９］。目前，原花青素已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日用化工等相關(guān)領(lǐng)域，并發(fā)揮著不可替代的作用，隨著天然產(chǎn)物生產(chǎn)加工的逐漸興起，原花青素更成為天然產(chǎn)物和有機(jī)化學(xué)的研究熱點(diǎn)［１０－１３］。不過，對(duì)于酸櫻桃果實(shí)中原花青素的開發(fā)利用，目前國內(nèi)尚處于起步階段，還未見相關(guān)報(bào)道，因此，從酸櫻桃果實(shí)中提取原花青素并進(jìn)行分離純化的研究具有較大的開發(fā)潛力和實(shí)用價(jià)值。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑酸櫻桃：吉林市九站試驗(yàn)基地提供；ＮＫＡ樹脂：南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)；無水乙醇、甲醇、甲酸、石油醚、乙酸乙酯均為分析純。

１．１．２主要儀器與設(shè)備循環(huán)水式多用真空泵（ＳＨＢ－Ｂ９５）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；恒溫水浴鍋（Ｂ－２６０）：上海亞榮生化儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（ＲＥ５２ＣＳ－１）：上海亞榮生化儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)（ＦＤ）：北京博醫(yī)康儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（ＳＣＲ２０ＢＣ）：日本日立公司；電子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；ＵＶ－２５０１ ＰＣ型分光光度計(jì)：日本島津公司；Ｗａｔｅｒｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＺＭＤ４０００液質(zhì)聯(lián)用儀；Ｗａｔｅｒｓ ２６９０液相色譜儀（包括梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器等）；Ｗａｔｅｒｓ ９６６二極管陣列檢測器。

１．２方法

１．２．１原花青素的測定方法采用鹽酸－香草醛法［１４］。

１．２．２原花青素提取液的制備方法酸櫻桃經(jīng)清洗、去核后，用膠體磨處理１５ ｍｉｎ，按溶劑與物料質(zhì)量比１∶４加入體積分?jǐn)?shù)為７０％的乙醇，在６０ ℃下冷凝回流提取２次，每次４ ｈ。合并兩次提取液，冷凍干燥后得原花青素提取液。

１．２．３原花青素萃取分離的方法提取液中的脂類等雜質(zhì)不利于純化分析，因此，須對(duì)提取液進(jìn)行萃取分離。①脫脂：向提取液中加入３倍體積的石油醚，混勻，在分液漏斗中靜置至分層，放出下層溶液，所放出溶液再重復(fù)一遍脫脂操作；②萃取分離：向脫脂后的提取液中加入２倍體積的乙酸乙酯，混勻后在分液漏斗中靜置至分層，除去下層溶液保留上層溶液，將上層溶液重復(fù)此操作３次，最后蒸餾濃縮除去乙酸乙酯，得到原花青素萃取液。

１．２．４NKA樹脂吸附的方法

１）NKA樹脂的預(yù)處理。將NKA樹脂在無水乙醇中浸泡２４ ｈ，除去樹脂中雜質(zhì)，然后濕法裝柱。裝好后，用去離子水以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速?zèng)_洗樹脂柱，直到無乙醇?xì)埩?；以同樣的流速，將０．０?ｇ／Ｌ的ＨＣｌ通過樹脂柱，２ ｈ后再以去離子水洗至中性，接著以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速，將０．０５ ｇ／Ｌ的ＮａＯＨ水溶液通過樹脂柱，２ ｈ后再以去離子水洗至其洗出液至中性，備用。

２）最佳上樣流速的確定。稱?。撤菀烟幚砗玫臉渲鳎?ｇ，分別以流速０．５、１．０、２．０ ｍＬ／ｍｉｎ通入原花青素萃取液，每間隔２ ｍＬ測定流出液吸光值，根據(jù)結(jié)果確定最佳上樣流速。

３）最佳上樣濃度的確定。將等量原花青素萃取液稀釋成不同濃度，然后以最佳上樣流速分別通入樹脂柱。通過比較吸附前后其吸光值的變化，利用（Ａ０－Ａ１）／Ａ０×１００％計(jì)算出吸附率，其中Ａ０為上樣液的吸光值，Ａ１為樣品全部通過樹脂柱后流出液的吸光值。

４）最佳洗脫流速的確定。稱?。卜菀烟幚砗玫臉渲鳎?ｇ，分別以最佳上樣流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，進(jìn)樣完畢后，依次用體積分?jǐn)?shù)為５０％的乙醇溶液以１.0、２.0 ｍＬ／ｍｉｎ洗脫，每間隔２ ｍＬ測定洗脫液的吸光值，直至洗出液為無色時(shí)為止，根據(jù)結(jié)果確定最佳洗脫流速。

５）最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定。稱?。捣菀烟幚砗玫臉渲鳎?ｇ，分別以最佳上樣流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，進(jìn)樣完畢后，按照最佳洗脫流速，依次用去離子水、體積分?jǐn)?shù)為３５％、５５％、７５％、９５％的乙醇溶液洗脫，至洗出液為無色時(shí)為止，測定洗脫液的吸光值，確定最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

１．２．５純化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析法樹脂流出的洗脫液在４０℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后在－６０℃條件下冷凍干燥，得到暗紅色油狀物（該物質(zhì)溶于甲醇），再經(jīng)０．４５μｍ膜過濾后用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析。

色譜條件：色譜柱Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ（５ μｍ，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）；流動(dòng)相Ａ.甲酸－水（甲酸∶水＝１∶９９，Ｖ／Ｖ），Ｂ.甲醇－甲酸－水（甲醇∶甲酸∶水＝８０∶１∶１９，Ｖ／Ｖ／Ｖ）；按小于５ ｍｉｎ、１００％（Ｖ／Ｖ）Ａ，５～５０ｍｉｎ、２０％（Ｖ／Ｖ）Ａ＋８０％（Ｖ／Ｖ）Ｂ，流速１.0 ｍＬ／ｍｉｎ進(jìn)行梯度洗脫。柱溫３０ ℃，進(jìn)樣量２０ μＬ，檢測分流比５∶１。

質(zhì)譜條件：掃描方式——負(fù)離子掃描（ＥＳＩ，ｍ／ｚ ２６０～１ ５００），毛細(xì)管電壓４．２ ｋＶ，錐孔電壓５０ Ｖ，光電倍增器電壓６５０ Ｖ，離子源溫度１２０ ℃，脫溶劑氣溫度３００ ℃。

２結(jié)果與分析

２．１ＮＫＡ樹脂的分離與純化

２．１．１最佳上樣流速的確定根據(jù)測定結(jié)果，以流出液的體積對(duì)應(yīng)流出液的吸光值作圖，得到不同上樣流速下的吸附曲線，如圖１所示。由圖１可見，上樣流速為２．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，流出液在３ ｍＬ后吸光值即開始急劇增加，泄露點(diǎn)出現(xiàn)過早，所以樣品中的原花青素未能及時(shí)擴(kuò)散到樹脂內(nèi)部和樹脂達(dá)到吸附平衡就流出，吸附量較少；上樣流速為０．５ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，流出液在７ ｍＬ后才出現(xiàn)泄露點(diǎn)，原花青素有充分的時(shí)間進(jìn)入樹脂內(nèi)部而被吸附分配，吸附性較好，但流速慢，吸附時(shí)間過長；而上樣流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)的吸附曲線與０．５ ｍＬ／ｍｉｎ的非常接近，說明二者的吸附效果相差不大。因此綜合考慮，本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上樣流速，既有較高的吸附性又可提高分析效率。

２．１．２最佳上樣濃度的確定上樣濃度對(duì)NKA樹脂吸附效果的影響見圖２所示。由圖２可見，隨著上樣濃度的增加，吸附率先升高后降低。在上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ時(shí)，吸附率最高；之后，隨著上樣濃度的增加，吸附率反而下降，其原因可能是由于當(dāng)上樣濃度過大時(shí)，會(huì)發(fā)生多層吸附，而且易堵塞樹脂，影響吸附效率。因此，確定最佳上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ。

２．１．３最佳洗脫流速的確定根據(jù)測定結(jié)果，以洗脫液體積對(duì)應(yīng)洗脫液的吸光值作圖，得到不同洗脫流速下的洗脫曲線，如圖３所示。從圖３可以看出，洗脫流速越低，吸附樹脂和洗脫劑之間接觸時(shí)間越長，相互作用越充分，能較好地將原花青素從NKA樹脂中解吸出來，洗脫流速越高，洗脫時(shí)的脫尾現(xiàn)象越明顯，洗脫相同量的原花青素所需的洗脫劑越多。當(dāng)洗脫流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，洗脫高峰比較集中，洗脫劑用量少，脫尾現(xiàn)象不明顯，且較好地解吸了被樹脂吸附的原花青素。因此本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ作為洗脫流速。

２．１．４最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定根據(jù)測定結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)洗脫液吸光值作圖，得到如圖４所示的曲線。由圖４可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，洗脫液吸光值不斷增大，說明解吸率不斷增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到９５％時(shí)，解吸效果最好，所以本研究中采用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

２．２純化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析

經(jīng)ＮＫＡ樹脂純化后的原花青素通過ＨＰＬＣ分析，得到了如圖５Ａ所示的色譜圖。由圖可見，純化物中主要含有兩種單體組分Ｍ１和Ｍ２（其保留時(shí)間分別為１２．８２８、１４．９７３ ｍｉｎ），其對(duì)應(yīng)的ＥＳＩ-MS質(zhì)譜圖如圖５Ｂ、５Ｃ所示。

從圖５Ｂ可知，組分Ｍ１的分子離子峰為４５３．１（Ｍ＋１），確認(rèn)該化合物的分子量為４５２，與原花青素－３－葡萄糖苷分子量一致，因此推斷組分Ｍ１為原花青素－３－葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖６。

從圖５Ｃ可知，組分Ｍ２的質(zhì)譜圖中含有（－）－表兒茶素沒食子酸酯的分子離子峰４４１．２（Ｍ＋１）、失去沒食子?；纬傻碾x子峰２８９．３和其他一些碎片離子信息，因此推斷組分Ｍ２為（－）－表兒茶素沒食子酸酯，其結(jié)構(gòu)如圖７。

３結(jié)論與討論

ＮＫＡ樹脂對(duì)原花青素具有較好的吸附和解吸能力，是分離酸櫻桃中原花青素較理想的吸附劑。經(jīng)試驗(yàn)分析，得到以下結(jié)論。

１）上樣流速為０．５ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)吸附性最好，但分析時(shí)間過長，而１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上樣流速與其吸附效果相差不大，因此，本研究選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ為上樣流速，既有較高的吸附性又可提高分析效率。

２）上樣濃度越大，樹脂吸附量越多，吸附率越高，但如上樣濃度過高，又可能導(dǎo)致多層吸附，且易堵塞樹脂，影響吸附效率。根據(jù)吸附曲線，確定最佳上樣濃度為７ ｍｇ／ｍＬ。

３）洗脫流速越低，吸附樹脂和洗脫劑之間接觸時(shí)間越長，相互作用越充分，能較好地將原花青素從NKA樹脂中解吸出來，洗脫流速越高，洗脫時(shí)的脫尾現(xiàn)象越明顯，洗脫相同量的原花青素所需的洗脫劑越多。所以選擇１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速作為洗脫流 速。

４）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)原花青素的解吸效果有也較大的影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為９５％時(shí)解吸效果最好，所以本研究中采用體積分?jǐn)?shù)為９５％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。

５）分離、純化后的原花青素經(jīng)ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析，確定其主要含兩種組分，分別為（－）－表兒茶素沒食子酸酯和原花青素－３－葡萄糖苷。

通過試驗(yàn)分析，確定了樹脂分離、純化酸櫻桃中原花青素的最佳工藝條件，并利用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ定性了純化物的主要成分，為酸櫻桃中原花青素的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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