硬骨魚類MHCⅠ基因結(jié)構(gòu)與抗病力關(guān)系探討

賈震虎，夏 春

（1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)院，山西 臨汾 041004；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193）

在經(jīng)歷了數(shù)億年的演變與進(jìn)化后，硬骨魚類形成了具有種屬特征的抗感染以及穩(wěn)定自身的特異性免疫應(yīng)答系統(tǒng)；而在其特異性免疫應(yīng)答系統(tǒng)中，由于MHCⅠ（major histocompatibility complex classⅠ）型分子的主要功能是與病毒等內(nèi)源性蛋白多肽結(jié)合，并提呈至限制性CD8＋T 細(xì)胞，促進(jìn)殺傷性CD8＋T細(xì)胞的形成。在硬骨魚類的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，因而與動(dòng)物疾病的抵抗力密切相關(guān)。最近，一些報(bào)道也證實(shí)了硬骨魚類MHCⅠ與其對(duì)疾病的抗性與易感性密切相關(guān)，并決定對(duì)各種疫苗的免疫應(yīng)答［1］。而硬骨魚類為提升自身對(duì)疾病的抗性則應(yīng)對(duì)病原對(duì)物種的毀滅，其生存策略是形成了具有種屬特征的MHCⅠ基因結(jié)構(gòu)。

1 多樣的多肽結(jié)合區(qū)PBR（peptide-binding region）

人和哺乳動(dòng)物MHCⅠ基因座的共同特征是高度多態(tài)、抗原肽結(jié)合位點(diǎn)保守以及表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面。晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，人、鼠、猴、雞MHCⅠ型分子均由α1和α2區(qū)形成兩α螺旋組成PBR，其底部有6個(gè)小口袋，用于錨定CTL（cytotoxic T lymphocyte）表位，而且經(jīng)典MHCⅠ的錨定氨基酸殘基十分保守［2］。現(xiàn)有的研究表明，硬骨魚類MHCⅠ型分子的結(jié)構(gòu)和哺乳動(dòng)物相似，硬骨魚類經(jīng)典的MHCⅠ型分子的 重鏈與位于不同染色體上的β2m微球蛋白基因編碼的輕鏈非共價(jià)結(jié)合后，其中MHCⅠ型分子的 重鏈的胞外區(qū)中的α1和α2區(qū)域形成PBR，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PBR結(jié)合抗原肽，形成三分子復(fù)合體；隨后與CD4－CD8＋陽性細(xì)胞上TCR及其共受體結(jié)合、傳導(dǎo)信號(hào)激活T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體的特異性CTL免疫應(yīng)答［3］。CTL免疫應(yīng)答在機(jī)體清除病毒感染以及抗腫瘤免疫過程中起著關(guān)鍵性的作用。因此，硬骨魚類對(duì)病毒、寄生蟲以及腫瘤是否產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答以及免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱本質(zhì)上取決于其MHCⅠ－肽復(fù)合體能否與CTL細(xì)胞結(jié)合及其親和力的大小。

硬骨魚類MHCⅠ型分子結(jié)合抗原肽，引發(fā)機(jī)體的特異性CTL免疫應(yīng)答揭示了其最富于多態(tài)的部分也集中于PBR。Persson等［4］采用PCR方法和Southern-blot的方法從一條大西洋鱈個(gè)體的脾臟cDNA文庫中篩選出了17條不同的克隆，可以分成兩類，序列差異主要在PBR，而α1變異并不大。Aoyagi等［5］在研究虹鱒MHCⅠ時(shí)獲得大量高度多樣性的序列但卻都是來自同一個(gè)基因座，這些基因的PBR同樣是高度變異的。由此可見PBR的多樣性使硬骨魚類產(chǎn)生不同的等位基因從而呈遞不同的抗原多肽，抗原呈遞的這種變異就可能在功能上導(dǎo)致抗病力的差異。

2 MHC I基因高度多態(tài)

2.1 不同個(gè)體具有多態(tài)性 MHCⅠ基因是已知最具多態(tài)性的基因，也是抗原呈遞途徑中的關(guān)鍵基因。MHCⅠ基因的多態(tài)性與抗病能力有重要的關(guān)系，每個(gè)個(gè)體中的多態(tài)性使得MHC能夠結(jié)合和呈遞不同抗原到T細(xì)胞中，從而影響T細(xì)胞識(shí)別。夏春等［6］在研究虹鱒不同品系MHCⅠ型基因的多態(tài)性時(shí)就指出MHCⅠ的這種多態(tài)性將有助于闡明品系間不同MHC等位基因抗病表現(xiàn)力的相關(guān)性。同時(shí)從草魚cDNA文庫中克隆了MHCⅠ基因（Ctid-MHCⅠ），并通過對(duì)12個(gè)個(gè)體MHCⅠ的克隆分析了其等位基因的多態(tài)性和三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，MHCⅠ等位基因可分為六類Ctid-MHCⅠ2UA～UF），9型（A-I），但其三級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原多肽結(jié)合的關(guān)鍵性氨基酸十分保守。通過對(duì)草魚MHCⅠ的序列分析，結(jié)合已知的軟骨魚、硬骨魚、兩棲類、鳥類、哺乳類和人MHCⅠ氨基酸序列，構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹提示了我國大陸架上魚類、兩棲類、鳥類、哺乳動(dòng)物和人的遺傳距離與分枝年代［7］。

2.2 有數(shù)目不一的基因座 在龐大的硬骨魚類的種間與種群內(nèi)，經(jīng)典MHCⅠ基因座發(fā)生過十分巨大的變異與演化，結(jié)果導(dǎo)致了目前等位基因座的不對(duì)稱性與明顯差異。

迄今為止，人、哺乳類、爬行類、兩棲類、鳥類以及魚類基因組測(cè)序表明，有頜脊椎動(dòng)物均存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的MHCⅠ基因座。Hashimoto等最早報(bào)道了鯉魚MHCⅠ基因。隨著鯊魚、虹鱒、大西洋鮭、希臘魚、斑馬魚、河鲀、鯰魚、大西洋鱈、青鳉、草魚等不同種屬魚類的MHCⅠ基因被相繼克隆報(bào)道［8］。另外，河鲀、斑馬魚、青鳉、虹鱒、大西洋鮭全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成或正在推進(jìn)，歐美主要經(jīng)濟(jì)魚類MHCⅠ的基因座數(shù)目與結(jié)構(gòu)，以及等位基因多態(tài)性已十分清楚。Michalová等［9］采用染色體步移法揭示了斑馬魚MHCⅠ區(qū)長約450kb，包含至少19個(gè)基因座，其中包括3個(gè)MHCⅠ基因座（Dare-UDA，-UEA，-UFA），5個(gè)蛋白酶體亞單位β（PSMB8，-9A，-9C，-11，-12），2 個(gè) TAPs（TAP2A，TAP2B）和1個(gè)TAP結(jié)合蛋白（TAPBP）。而在人和鼠中，PSMB8，TAP，TAPBP位于 MHCⅡ區(qū)。除此之外，斑馬魚還存在一個(gè)約150 kb的次要classⅠ區(qū)，包含兩個(gè) MHCⅠ基因座（Dare-UBA，-UCA）和至少其他5個(gè)基因座，它可能代表一個(gè)不同的MHCⅠ單倍體模型。

大西洋鮭有8個(gè)MHCⅠ基因座分別為（UCA，UDA，UEA，UFA，UGA，UHA，ULA和ZE），但是Miller等［10］發(fā)現(xiàn)新的大西洋鮭的 MHCⅠ基因的UBA基因，可以界定為MHCⅠα，與其他等位基因的氨基酸序列的同源性非常低，只有34%，與表達(dá)的基因座（UHA和ZE）無任何關(guān)系，由此斷定UBA基因是目前發(fā)現(xiàn)的進(jìn)化最為遠(yuǎn)古的MHCⅠ基因座。而Kjoglum等［11］的研究大西洋鮭 MHCⅠ和MHCⅡ的不同基因型之間可以進(jìn)行聯(lián)合作用，在抗病感染中發(fā)揮協(xié)同作用，說明了外界環(huán)境對(duì)MHC基因型的影響作用。不同種類的MHC基因座是不同的，但是同一種魚類，其MHC基因座的數(shù)目也可能不同。Osterhout［12］在研究古比魚時(shí)發(fā)現(xiàn)野生的和觀賞的古比魚的MHC基因等位基因的數(shù)目存在較大的差異，原因不能僅僅歸結(jié)于飼養(yǎng)環(huán)境的不同，可能的原因還是由于基因插入、轉(zhuǎn)置的結(jié)果。

3 具有干擾素刺激應(yīng)答元件ISRE（ifn-stimulated response sequence）

干擾素（Interferon，IFN）本身沒有直接殺傷病毒作用，需要誘導(dǎo)一系列抗病毒蛋白的表達(dá)才能建立宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)。因而是一個(gè)重要的免疫調(diào)節(jié)因子；其調(diào)控依賴于基因在5＇端側(cè)翼區(qū)有一段干擾素刺激應(yīng)答元件（ISRE），該順式作用序列是基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子［13］。近來夏春等通過研究草魚MHCⅠ基因組［14］，發(fā)現(xiàn)魚和人以及哺乳動(dòng)物經(jīng)典MHCⅠ在啟動(dòng)子區(qū)域有共同的結(jié)構(gòu)：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄區(qū)由4個(gè)保守區(qū)域組成，分別存在S-box、X1X2、EnhB（Y）結(jié)構(gòu)和GAAA基序，以及ISRE基序。結(jié)果暗示了干擾素可上調(diào)MHCⅠ基因表達(dá)；并通過試驗(yàn)證明rCtid-IFN刺激后，MHCⅠ基因在主要免疫器官中的表達(dá)量明顯增加，而頭腎中的表達(dá)不受影響。這一結(jié)果與IFN刺激人細(xì)胞系和血淋巴細(xì)胞8～24h之后，可誘導(dǎo)其MHCⅠ出現(xiàn)表達(dá)高峰類似。從而證明了硬骨魚IFN可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MHCⅠ的表達(dá)，從蛋白與分子水平證實(shí)了硬骨魚類MHCⅠ的免疫生物學(xué)功能，即IFN調(diào)節(jié)MHCⅠ的表達(dá)這一生化途徑也存在于進(jìn)化位置更低端的硬骨魚類［15］。同時(shí)也證實(shí)了硬骨魚類MHCⅠ雖然結(jié)構(gòu)上比較簡單，但抗原呈遞中關(guān)鍵基因以及多種免疫基因啟動(dòng)子調(diào)控元件的克隆，說明硬骨魚類擁有與高等生物相似的抗原呈遞途徑和活化機(jī)制。

4 小結(jié)

硬骨魚類在長期的進(jìn)化過程中，則應(yīng)對(duì)病原對(duì)物種的毀滅以及提升自身對(duì)疾病抗性的需要，擁有了與高等生物相似但又具有種屬自身特征的MHCⅠ基因結(jié)構(gòu)。

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