杜仲提取物對小鼠皮膚光老化保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

李建民,劉琦,王雪,張寧,徐艷明,陳巧云

[摘要]目的：研究杜仲提取物對光老化模型小鼠皮膚的保護(hù)作用。方法：用紫外光療儀（UVA+UVB，模擬日光）照射KM小鼠，建立光老化小鼠模型，灌胃或外用給予杜仲提取物，觀察小鼠皮膚的組織形態(tài)，測定小鼠血漿中超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果：外用及灌胃低劑量杜仲提取物均能有效提高小鼠血漿中SOD活力（P＜0.05）、降低MDA含量（P＜0.05），且外用能顯著減輕小鼠皮膚組織受損程度。結(jié)論：杜仲提取物具有抗皮膚光老化的作用，且外用優(yōu)于口服，作用機(jī)制可能與其能夠清除自由基和活性氧，從而防止組織過氧化損傷有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]杜仲；光老化；丙二醛；超氧化物歧化酶

[中圖分類號]R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號]1008-6455（2012）03-0584-03

Experimental study on the protective effect of eucommia extract on the mice skin photoaging

LI Jian-min,LIU Qi,WANG-Xue,ZHANG Ning,XU Yan-ming,CHEN Qiao-yun

(School of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007, Heilongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effects of Eucommia extract on the skin of photoaging-model mice.MethodsIrradiate KM mice with UV (UVA+UVB, simulate soler) machine to develop photoaging-model mice,Eucommia extract were given by Internal and external,then the histology of skin tissue was observed,the activities of superoxide dismutase (SOD) and the contents of malondialdehyde (MDA) were examined.ResultsEucommia extract could enhance the activities of SOD (P<0.05), decrease the contents of MDA in both Internal and external (P<0.05),histological observation showed that external could improve the damage degree of the skin of mice.ConclusionEucommia extract has the protective effect on the skin of photoaging-model mice,external is better than Internal,the mechanism may be related to eliminating free radicals and active oxygen,protecting the skin tissue from peroxide damage.

Key words:eucommia; photoaging; MDA; SOD

前期研究證明杜仲提取物對長波紫外線及中波紫外線致表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞光老化均有保護(hù)作用[1-3]，從細(xì)胞水平驗(yàn)證了杜仲提取物具有抗皮膚光老化的潛力。本實(shí)驗(yàn)選擇KM小鼠為研究對象，建立小鼠光老化動(dòng)物模型，采用灌胃和外用兩種方式，通過HE染色制片觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)改變，試劑盒法測定小鼠血漿超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量，在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)一步驗(yàn)證其抗皮膚光老化的作用，并初步探討其機(jī)制。

1材料和儀器

1.1材料：清潔級KM小鼠48只，體重（20±2）g，雌性（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2儀器：紫外光療儀（Sigma公司），紫外線輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠），Rsearch UV UF型超純水制備系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司），YB1201DW型電子天平（上海海康電子儀器廠），8-5K離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），半自動(dòng)生化分析儀（四川美生科技有限公司），脫毛膏（薇婷）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1藥液的制備：口服藥液的制備：將杜仲提取物[1]溶于蒸餾水中分別制成0.1g·ml-1和0.3g·ml-1的藥液。外用藥的制備：將16醇和十六烷基糖苷、單硬脂酸甘油酯、橄欖油、角鯊?fù)椤⑹?十八醇混合后升溫至80℃溶解制得油相；將甘油加入去離子水中，升溫至80℃，加入對羥基苯甲酸甲酯，攪拌至全部溶解，制得水相；然后，將水相加入油相中，均質(zhì)8min，攪拌降溫至40℃，加入用丙二醇分散的杜仲提取物，攪拌至分散均勻，制成含1.5%杜仲提取物的乳霜。

2.2小鼠光老化模型的建立：各組小鼠稱重，做標(biāo)記，全價(jià)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。除空白組外其余各組小鼠每天或每2天用脫毛膏將背部毛脫干凈，面積2cm×2cm。將小鼠置于紫外光療儀燈具下（UVA+UVB，模擬日光）照射，照射距離40cm。每天照射15min，連續(xù)照射20天，達(dá)到累計(jì)照射劑量UVA為20.6mJ·cm-2、UVB為1.8mJ·cm-2，造模完成。

2.3分組及給藥：小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，分為空白組、蒸餾水灌胃組、高劑量灌胃組、低劑量灌胃組、外涂基質(zhì)組、外涂藥物組?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)；蒸餾水灌胃組：造模，每天灌胃蒸餾水；高劑量灌胃組：造模，每天按3.2mg·g-1體重的劑量灌胃；低劑量灌胃組：造模，每天按0.8mg·g-1體重的劑量灌胃；外涂基質(zhì)組：造模，每天涂乳霜基質(zhì)0.1g；外涂藥物組：造模，每天涂抹含杜仲提取物的乳霜0.1g。

2.4取材：第21天，用乙醚麻醉小鼠，置于手術(shù)臺(tái)上，剃毛，常規(guī)手術(shù)取下實(shí)驗(yàn)暴露部位皮膚，浸入10%福爾馬林中固定24h。摘眼球取血1ml，置于EDTA抗凝管中，3000r/min離心10min，取血漿。

2.5指標(biāo)觀測

2.5.1皮膚病理切片觀察：將取下的組織塊浸入10%甲醛固定。12h后，取出固定好的組織塊進(jìn)行蠟塊包埋。蠟塊切片后，將切片HE常規(guī)染色。

2.5.2小鼠血漿中SOD、MDA測定：取10μl小鼠血漿按SOD測定試劑盒說明進(jìn)行檢測，取100μl小鼠血漿按MDA測定試劑盒說明進(jìn)行檢測。

2.6統(tǒng)計(jì)處理：所有數(shù)據(jù)均通過SPSS18.0軟件完成數(shù)據(jù)分析，計(jì)算資料以x±s表示，各組間均值比較采用方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1灌胃給予杜仲提取物對光老化模型小鼠的影響

3.1.1皮膚一般形態(tài)：與空白組相比，蒸餾水灌胃組小鼠背側(cè)表皮有早期輕度紅斑形成，隨著照射劑量的增加皮膚顏色加深、增厚、脫屑，嚴(yán)重者出現(xiàn)皺縮、粗糙變硬，失去彈性及光澤；與蒸餾水灌胃組相比，灌胃給藥組小鼠無明顯變化。

3.1.2皮膚組織形態(tài)學(xué)：見圖1?？瞻捉M小鼠皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，厚度正常，細(xì)胞成分及數(shù)量適中，真皮層可見波浪狀纖維組織，排列有序，分布均勻，疏密有致。而蒸餾水灌胃組小鼠表皮層增厚并伴有角質(zhì)層變厚，細(xì)胞分層不清；真皮層因纖維組織發(fā)生變性或破壞，纖維排列紊亂，分布不均，并有較多的炎性細(xì)胞浸潤。與蒸餾水灌胃相比，高、低劑量灌胃組小鼠皮膚組織有部分改善，但仍可見表皮角質(zhì)層增厚，真皮層纖維組織斷裂、破碎，卷曲扭結(jié)。說明灌胃給予杜仲提取物能夠減輕小鼠皮膚光老化的程度。

3.1.3小鼠血漿中SOD活力、MDA含量：結(jié)果見表1。與空白組相比，蒸餾水灌胃組小鼠血漿中SOD活力明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05）。與蒸餾水灌胃組相比，高劑量灌胃組小鼠血漿中SOD活力無顯著性差異、MDA含量明顯降低（P＜0.05）；低劑量灌胃組小鼠血漿中SOD活力明顯升高（P＜0.05）、MDA含量明顯降低（P＜0.05）。

3.2 外用杜仲提取物對光老化模型小鼠的影響

3.2.1皮膚一般形態(tài)：與空白組相比，外涂基質(zhì)組小鼠背側(cè)表皮顏色加深、增厚、脫屑，嚴(yán)重者出現(xiàn)皺縮、粗糙變硬；與外涂基質(zhì)組相比，外涂藥物組小鼠背側(cè)表皮僅有稍許皮膚增厚，無脫屑、顏色加深。

3.2.2皮膚組織形態(tài)學(xué)：見圖2?？瞻捉M小鼠皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，厚度正常，細(xì)胞成分及數(shù)量適中，真皮層可見波浪狀纖維組織，排列有序，分布均勻，疏密有致。而外涂基質(zhì)組大部分小鼠表皮層增厚并伴有角質(zhì)層變厚，細(xì)胞分層不清。纖維排列紊亂，分布不均。與外涂基質(zhì)組相比，外涂給藥組小鼠皮膚組織受損程度明顯減輕，較接近正常組織，表皮稍有增厚，真皮層可見較完整的纖維組織，少見斷裂、破碎，未出現(xiàn)卷曲扭結(jié)。說明EE外用能有效地改善小鼠皮膚纖維組織的病變，延緩皮膚的光老化。

3.2.3 小鼠血漿中SOD活力、MDA含量：結(jié)果見表2。與空白組相比，外涂基質(zhì)組小鼠血漿中SOD活力明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05）；與外涂基質(zhì)組相比，外涂藥物組小鼠血漿中SOD活力明顯升高（P＜0.05）、MDA含量顯著降低（P＜0.01）。

4討論

4.1 本實(shí)驗(yàn)采用的是復(fù)合光源（UVA+UVB）模擬日光，采用小劑量紫外線長時(shí)間照射小鼠皮膚的方法，最大程度地模擬皮膚自然光老化的病理過程。實(shí)驗(yàn)過程中，選擇遠(yuǎn)距離照射，避免動(dòng)物皮膚在短時(shí)間內(nèi)被灼傷[3]，經(jīng)摸索發(fā)現(xiàn)40cm為照射最佳距離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量灌胃組小鼠血漿中SOD活力明顯升高（P＜0.05）、MDA含量明顯降低（P＜0.05），療效優(yōu)于高劑量組，說明高濃度的杜仲提取物可能會(huì)有毒性作用，而低濃度的杜仲提取物藥效較好。

4.2 本實(shí)驗(yàn)對照組與空白組的結(jié)果比較顯示，灌胃或外涂蒸餾水組小鼠皮膚組織的SOD降低，MDA升高，SOD減少使組織抗氧化防御體系作用減弱，過量的MDA進(jìn)一步與磷酸酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無活性的大分子復(fù)合物即脂褐素[4]，加重機(jī)體皮膚光老化。灌胃或外用給予杜仲提取物后，HE切片結(jié)果顯示，杜仲提取物減輕了皮膚松弛、紅斑、多皺紋等皮膚光老化現(xiàn)象，改善皮膚外觀狀態(tài)；小鼠血漿中SOD活力明顯升高、MDA含量明顯降低，說明杜仲提取物起到了外源性的抗氧化劑作用并使機(jī)體內(nèi)氧化還原體系重新恢復(fù)平衡。從灌胃組和外用組的結(jié)果看，外用杜仲提取物對小鼠血漿中SOD尤其是MDA含量的影響比灌胃效果好，且中藥外用具有低免疫原性、低毒副作用和皮膚耐受的優(yōu)點(diǎn)，故采用外用杜仲提取物比灌胃更簡潔、方便、低毒、高效。

4.3 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杜仲提取物對皮膚光老化有一定改善作用，其機(jī)制與杜仲提取物能清除自由基和活性氧，防止其造成組織過氧化損傷有關(guān)。通過此實(shí)驗(yàn)研究不僅為杜仲抗衰防皺功效型產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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[收稿日期]2011-09-24 [修回日期]2011-12-26

編輯/張惠娟