阻斷Notch信號(hào)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分泌功能的研究

李冰,刁建升,楚菲菲,王大雷,郭樹忠,夏煒

[摘要]目的：探討Notch信號(hào)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌功能的影響及意義。方法：采用角質(zhì)形成細(xì)胞的血清刺激模型研究Notch信號(hào)對(duì)其分泌功能的影響。結(jié)果：血清刺激可以明顯促進(jìn)Notch受體，配體及下游基因的表達(dá)，其中Notch1，Jagged1的表達(dá)明顯上升并具有時(shí)間依賴性，其下游蛋白P21表達(dá)升高，并在血清刺激后6h達(dá)到高峰，P63表達(dá)下降，并在血清刺激后6h，下降幅度最大。此外給予血清刺激后，纖維化相關(guān)因子（包括TGF-β1，TGF-β2，IGF-1，CTGF，VEGF及EGF）的表達(dá)明顯升高，并在12h達(dá)到高峰。給予DAPT（N-[N-(3,5-Difluorophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester，γ分泌酶抑制劑)進(jìn)行Notch信號(hào)阻斷后，明顯抑制其下游蛋白P21的表達(dá)，提高的P63的表達(dá)水平，同時(shí)抑制了纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。結(jié)論：阻斷Notch信號(hào)能夠明顯抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌纖維化相關(guān)因子。

[關(guān)鍵詞]瘢痕；Notch信號(hào)；角質(zhì)形成細(xì)胞；血清刺激模型；纖維化相關(guān)因子

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）04-0576-04

Blocking Notch signal pathway suppress profibrotic growth factor production in keratinocyte

LI Bing,DIAO Jian-sheng,CHU Fei-fei,WANG Da-lei, GUO Shu-zhong, XIA Wei

(Institute of Plastic Surgery, Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of Notch signaling on the profibrotic growth factor production in keratinocyte.MethodsTo mimic the components of the acute wound microenvironment, we used serum stimulation model in vitro.Results We found that expression of Notch1 and Jagged-1 in keratinocytes was significantly higher after serum stimulation, and shown time independent. After keratinocytes serum stimulation, the expression of P21 was significantly up-regulated and had a peak at 6h, while the expression of P63 was down-regulated with the biggest fall at 6h. Besides, the result of real time PCR suggested that nearly all the detected profibrotic growth factors had a peak at 12h after serum stimulation, in absence of DAPT. DAPT decreased the expression of profibrotic growth factor production at all the indicated time, and had the most potent effect at 12h. But in presence and absence DAPT, the variation tendency of TGF-β1 expression was nearly the same, so was VEGF. Maybe this is related to the low dose of DAPT(10μM).ConclusionBlocking Notch signaling pathway can suppress probrotic growth factor production in keratinocyte.

Key words:cicatrix; Notch signal pathway; keratinocyte; serum stimulation model; profibrotic growth factor

皮膚創(chuàng)傷后過(guò)度愈合常常導(dǎo)致瘢痕增生，尤其是大面積燒傷后常形成增生性瘢痕，不僅影響外表，而且常會(huì)給患者帶來(lái)功能障礙，影響患者身心健康。但其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確闡明。表皮異常的旁分泌功能在瘢痕增生中發(fā)揮著重要作用[1-3]。在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，在增生性瘢痕的表皮增厚，但其基底細(xì)胞減少，上層細(xì)胞增多，即表現(xiàn)為增殖減低，過(guò)度分化狀態(tài)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)相關(guān)分子在增生性瘢痕表皮過(guò)量表達(dá)及活化[4]。此外，本課題組前期利用DAPT局部注射能夠明顯抑制兔耳瘢痕增生[5]，同時(shí)增生性瘢痕表皮的過(guò)度分化狀態(tài)也得到了逆轉(zhuǎn)。Notch信號(hào)是調(diào)節(jié)表皮增殖分化的重要信號(hào)途徑，因此我們推測(cè)，創(chuàng)傷后，可能由于Notch信號(hào)相關(guān)分子的大量表達(dá)及過(guò)度活化導(dǎo)致表皮的增殖分化異常[6-7]，進(jìn)而產(chǎn)生大量的纖維化相關(guān)因子，導(dǎo)致瘢痕增生。本研究即通過(guò)血清刺激模型，體外模擬體內(nèi)急性創(chuàng)傷，來(lái)研究Notch信號(hào)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌功能的影響，為Notch信號(hào)在瘢痕增生中促進(jìn)作用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑及材料：角質(zhì)形成細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)ATCC公司，無(wú)血清KGM（Serum free basal keratinocyte growth medium，無(wú)血清角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基）及添加劑購(gòu)買與美國(guó)ATCC公司；胰酶及EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetie Acid，乙二胺四乙酸）產(chǎn)于英國(guó)Sigma公司，購(gòu)買于西安沃爾森生物技術(shù)公司；DAPT（N-[N-(3,5-Difluo rophenancetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butylester，γ分泌酶抑制劑)產(chǎn)于美國(guó)ALEXIS公司，購(gòu)買于西安沃爾森生物技術(shù)公司；FCS（（fetal calf serum，胎牛血清）產(chǎn)于美國(guó)Hyclone公司，購(gòu)買于西安沃爾森生物技術(shù)公司；TriPure分離試劑產(chǎn)于德國(guó)Roche公司，購(gòu)買于西安沃爾森生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒產(chǎn)于并購(gòu)買于大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)： 凍存的角質(zhì)形成細(xì)胞以1000～5000細(xì)胞/cm2密度復(fù)蘇后培養(yǎng)于無(wú)血清的KGM完全培養(yǎng)基中, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合，利用0.02%胰酶和0.05%EDTA進(jìn)行消化傳代，直到第四代細(xì)胞用于血清刺激模型建立。

1.2.2 血清刺激模型建立及DAPT處理： 將角質(zhì)形成細(xì)胞在KGM成基礎(chǔ)培養(yǎng)基中靜置17h，加入或不加10μM DAPT，孵育2h后，加入10%FCS，于血清刺激后0h、1h、6h、12h及24h收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)：采用TriPure試劑按說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。DNase I 37℃，10～3Omin，以去除基因組DNA污染。RNA沉淀，重懸后進(jìn)行定量。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green I染料在MJ Research 0ption 2熒光定量PCR儀上檢測(cè)目的基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系20μl。PCR反應(yīng)條件：激活95℃，10 min；40個(gè)循環(huán)，變性95℃，15 s；退火55℃，30 s，延伸72℃，30 s；分別在78℃、80℃、82℃和85℃時(shí)檢測(cè)熒光。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)行熔解曲線分析，95℃，1 min，65℃，l min，以0.10℃/s的速度升溫到95℃，連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光。擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線，在熔解曲線上以具有單峰判斷PCR擴(kuò)增的單一性。同時(shí)設(shè)無(wú)模板對(duì)照，每份標(biāo)本行3次Rea1-time PCR檢測(cè)，取平均值。對(duì)cDNA模板進(jìn)行倍比稀釋，以1.0×、0.5×、0.25×、0.125×四個(gè)濃度梯度的cDNA模板進(jìn)行Rea1-time PCR擴(kuò)增。將不同濃度模板的對(duì)數(shù)和相應(yīng)到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)(ct值)作圖，做標(biāo)準(zhǔn)曲線?；騧RNA表達(dá)采用直線相關(guān)回歸分析，管家基因GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參照，分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用STAT4．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析處理數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1 血清可以明顯刺激角質(zhì)形成細(xì)胞Notch信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)與活化。血清刺激后，Notch1及Jagged1表達(dá)明顯上升，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。此外，Notch下游分子，P21表達(dá)明顯升高，并在血清刺激后6h達(dá)到高峰（P=0.0004）；P63表達(dá)下降，并在血清刺激后6h下降幅度最大（P<0.0001）。

2.2 血清明顯刺激纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。由于給予細(xì)胞的是單次血清刺激，所以我們只能短時(shí)間觀察纖維化相關(guān)因子表達(dá)變化。其中TGF-β2、IGF-1、CTGF及EGF于血清刺激后12hmRNA表達(dá)高峰，到24h表達(dá)開始下降；而TGF-β1表達(dá)緩慢升高，直到血清刺激24h尚未出現(xiàn)明顯表達(dá)高峰；VEGF于血清刺激后1h即出現(xiàn)了明顯的高表達(dá)。

2.3 阻斷Notch信號(hào)抑制了纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。由于我們?cè)诮o予血清刺激前2h及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了DAPT處理，因此血清刺激0h，Notch信號(hào)下游分子及纖維化相關(guān)因子表達(dá)即出現(xiàn)不同的表達(dá)差異。DAPT明顯抑制了P21表達(dá)，1h即達(dá)到了最大的抑制作用（P<0.0001）；DAPT處理后，P63表達(dá)明顯升高，12h升高作用達(dá)到最大（P<0.0001）。TGF-β2（P=0.0147）、IGF-1（P<0.0001）、CTGF（P<0.0001）及EGF（P=0.0004）于血清刺激12h，DAPT的抑制作用達(dá)到最大；TGF-β1（P=0.0003）及VEGF（P=0.0033）于血清刺激1h，DAPT即有明顯抑制作用。

3 討論

Notch信號(hào)通路是人體重要信號(hào)通路之一，其信號(hào)分子在機(jī)體內(nèi)的各個(gè)器官中均有表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖及凋亡。皮膚作為人體重要的器官，Notch及其配體在表皮細(xì)胞的多種細(xì)胞均有大量表達(dá)，且特異性的Notch信號(hào)活化在維持皮膚細(xì)胞自身更新及分化過(guò)程中起到重要意義。

人類細(xì)胞的Notch存在五種配體：Delta like1，Delta like3，Delta like 4，Jagged1及Jagged2；及四種受體：即Notch1、Notch2、Notch3及Notch4。在人表皮中，各層表皮細(xì)胞均有Notch1分子表達(dá)，但Notch2只表達(dá)在基底細(xì)胞表面，而且Notch配體（例如：Jagged和Delta-like家族）與Notch受體作用是交叉的[8-9]。盡管Notch配體和受體的表達(dá)模式有差異，但通過(guò)對(duì)人類和小鼠的角質(zhì)形成細(xì)胞研究結(jié)果表明，任何配體激活的Notch信號(hào)都具有誘導(dǎo)分化的能力[10-11]。Notch在表皮的研究中，主要集中的Notch信號(hào)對(duì)表皮增殖及分化的調(diào)節(jié)作用的研究。在表皮，Notch信號(hào)活化后，直接誘導(dǎo)其下游分子P21表達(dá)，抑制P63表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)表皮分化，抑制表皮增殖。P21具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的功能，也被稱為Waf-1和Cip-1[10]。P21的表達(dá)增多會(huì)導(dǎo)致正在增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞向終末期細(xì)胞分化；而P63在維持表皮的增殖能力中起著重要作用。在Notch信號(hào)對(duì)病理性瘢痕的作用研究中發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕組織中出現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)渡分化，其原因可能與Notch1和Jagged1在角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)表達(dá)引起P21表達(dá)上調(diào)P63表達(dá)下調(diào)有關(guān)[11]。

表皮的分泌功能在皮膚的病理生理過(guò)程中都起到了重要作用。大量的研究表明，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的表皮常常會(huì)大量的分泌纖維化生長(zhǎng)因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF、PDGF、bFGF 等），這些生長(zhǎng)因子透過(guò)基底膜到達(dá)真皮，進(jìn)而促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成，導(dǎo)致瘢痕增生[12-14]。但是關(guān)于Notch信號(hào)對(duì)表皮分泌功能的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。而我們利用血清刺激模型進(jìn)行的體外研究發(fā)現(xiàn)，阻斷Notch信號(hào)后，不僅抑制了血清刺激的表皮的增殖能力下降及過(guò)度分化狀態(tài)，也抑制表皮細(xì)胞分泌纖維化相關(guān)因子（包括TGF-β、CTGF、IGF-1、EGF、VEGF）。

Notch信號(hào)是生物進(jìn)化中存在的非常保守的信號(hào)途徑之一。其活化后影響很多下游基因的轉(zhuǎn)錄，目前在表皮研究的Notch作用比較確定直接的下游分子即包括P21和P63，此外還有Wnt信號(hào)，AP-1等[5]。但是關(guān)于Notch對(duì)纖維化相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，目前相關(guān)研究還很少，而且多是集中在Notch信號(hào)于VEGF的相互作用在血管再生方面的研究[15]。關(guān)于Notch信號(hào)于TGF-β相互作用的研究多集中在內(nèi)臟器官的纖維化方面[16-17]，即TGF-β促進(jìn)了內(nèi)臟器官內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，阻斷Notch信號(hào)后，可以明顯抑制TGF-β的作用，但并未指出二者是上下游的調(diào)節(jié)關(guān)系。而我們的研究提示Notch信號(hào)參與表皮分泌纖維化相關(guān)因子的調(diào)節(jié)，阻斷Notch信號(hào)可以抑制表皮的分泌功能，進(jìn)而抑制瘢痕形成，為瘢痕形成提供了新的機(jī)制，為瘢痕防止提供新的治療思路。

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[收稿日期]2011-12-26 [修回日期]2012-02-16

編輯/張惠娟