比較四種脫鈣法對(duì)人牙免疫組化染色抗原性的影響

陳洪偉 劉英群 溫黎明 馮曉杰 李任

[摘要]目的：比較四種脫鈣方法對(duì)人牙牙體組織免疫組化染色抗原活性的影響。方法：40顆人牙隨機(jī)分為四組，分別在微波、超聲、微波-超聲聯(lián)合及常溫下用10%乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTA-2Na)脫鈣。應(yīng)用SABC免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白、纖維粘連蛋白在各組牙體組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：在微波-超聲聯(lián)合組脫鈣所需時(shí)間最短，且免疫組化染色效果最好﹙P＜0.05﹚；微波組脫鈣時(shí)間較超聲組略短，但二者免疫組化染色效果無顯著差異（P＞0.05）。常溫組所需脫鈣時(shí)間最長(zhǎng)且免疫組化染色效果最差。結(jié)論：微波-超聲聯(lián)合法脫鈣速度較快，免疫組化染色效果較好，是一種較為理想的脫鈣方法。

[關(guān)鍵詞]微波；超聲；牙齒；脫鈣方法；免疫組化

[中圖分類號(hào)]R783.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）06-0955-03

牙體組織結(jié)構(gòu)較為特殊，其硬組織中含有大量鈣鹽（洛氏硬度值達(dá)340）[1]，是全身最堅(jiān)硬的組織，不易切片極易脫片，因此在病理制片過程中首先要脫去其中的鈣鹽再進(jìn)行制片，而位于牙體硬組織中心的牙髓為柔軟的結(jié)締組織，在制片過程中易受擠壓、牽拉而至變形、分離甚至脫落流失，脫鈣不佳也會(huì)影響組織細(xì)胞染色效果或使組織抗原丟失[2]，從而影響對(duì)病變組織的病理診斷或科學(xué)研究工作。因此合適的脫鈣方法成為牙體組織制片，進(jìn)行免疫組化染色實(shí)驗(yàn)首先要解決的難題。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)微波、超聲、微波-超聲聯(lián)合脫鈣法的脫鈣效果，及不同脫鈣方法對(duì)牙體組織免疫組化染色抗原的影響程度進(jìn)行了初步檢測(cè)，旨在尋找出更適合牙體組織免疫組化染色實(shí)驗(yàn)的脫鈣方法。

1材料和方法

1.1 材料：收集因正畸拔除的健康人前磨牙40顆,患者年齡17～25歲,牙齒完好。經(jīng)生理鹽水沖洗后,入4%多聚甲醛溶液固定24h。

1.2 儀器試劑：微光波爐（WG700TL20Ⅱ-k6,廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司）；KQ118型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Ⅰ型膠原蛋白抗體(武漢博士德公司)；纖維粘連蛋白抗體(武漢博士德公司)；SABC試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 脫鈣液配制：10% EDTA脫鈣液：EDTA-2Na 100g，NaOH 10g，加雙蒸水1000ml于容量瓶中,微加溫溶解，調(diào)pH值至7.2～7.4[3]。

1.4 方法：40顆牙隨機(jī)分成四組：微波組（Ⅰ），超聲組（Ⅱ），微波-超聲聯(lián)合組（Ⅲ），常溫對(duì)照組（Ⅳ）。將四組牙分別放入四只250 ml小燒杯內(nèi)，各加入脫鈣液150～200ml。按下列四種方法脫鈣：Ⅰ組：將小燒杯放入加有冷水的500ml大燒杯內(nèi)；置于微波爐中（低檔，輸出功率150W），脫鈣10min后，取出降溫5min再進(jìn)行下一次脫鈣，每日脫鈣24次。Ⅱ組：將小燒杯放入超聲波清洗器中（35℃，150W），脫鈣10min，取出降溫5min再進(jìn)行下一次脫鈣，每日脫鈣24次。Ⅲ組：將小燒杯放入超聲清洗器中脫鈣10min（條件同Ⅱ組），再放入微波爐中脫鈣（條件同Ⅰ組）進(jìn)行第二次脫鈣，如此反復(fù)進(jìn)行，每日脫鈣24次。Ⅳ組：將小燒杯放于室溫下靜置脫鈣。注意各組脫鈣過程中脫鈣液溫度以不超過50℃為宜，各組每日更換新脫鈣液一次，直至脫鈣完成（以大頭針無阻力可刺入組織為脫鈣完成的標(biāo)志）。牙齒脫鈣完成后,常規(guī)石蠟包埋，唇舌向切片數(shù)張。進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.5 免疫組化染色：石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,蒸餾水洗5min×3次；3% H2O2室溫孵育10min,蒸餾水洗5 min×3次；室溫下復(fù)合消化酶消化10 min,PBS洗2 min×3次；滴加BAS封閉液,室溫20 min,甩去多余液體；分別滴加一抗（兔抗人Ⅰ型膠原抗體，抗體滴度1∶50；兔抗人纖維粘連蛋白抗體，抗體滴度1∶150），4℃過夜；PBS洗2 min×3次；生物素化二抗室溫孵育20 min,PBS洗2 min×3次；SABC液室溫作用20 min,PBS洗5min×4次；顯微鏡監(jiān)控下DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水、透明、樹膠封片,顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照片用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.6 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)，運(yùn)用Image-Pro-Plus圖像分析軟件進(jìn)行平均光密度值（integral optical density，IOD）測(cè)定，取其平均值。圖像分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x±s)形式表示。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值之間進(jìn)行Dunnett-t檢驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)組OD值之間進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 四種脫鈣方法完成脫鈣所需時(shí)間的比較 (見表1) 。

2.2 免疫組化染色結(jié)果：四種不同脫鈣方法免疫組化染色效果存在差異，兩種不同抗體染色結(jié)果均表明：微波-超聲聯(lián)合組免疫組化染色效果佳，好于其它各組(P<0.05，見圖1A,2A)；微波組，超聲組免疫組化染色效果好于常溫對(duì)照組﹙P＜0.05﹚，但微波組，超聲組之間無顯著差異（P＞0.05，見圖1B, 2B）；常溫組免疫組化染色結(jié)果最差（見圖2C）。不同脫鈣方法下脫鈣組織免疫組化學(xué)染色結(jié)果比較詳見表2。

3討論

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)是用已知的標(biāo)記的特異性抗體或抗原對(duì)組織內(nèi)相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測(cè)，從而了解抗原或抗體結(jié)合部位和含量的一門新興檢測(cè)技術(shù)[4]。在探討疾病的病因?qū)W、發(fā)病機(jī)制及科研工作中起到了不可估量的作用。免疫組化染色過程環(huán)節(jié)較多，而組織的脫鈣方法是牙體組織免疫組化染色的最關(guān)鍵的步驟之一。如果脫鈣不徹底可導(dǎo)致切片破碎甚至無法制片，脫鈣方法不佳導(dǎo)致組織抗原丟失影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，如何快速有效脫鈣至關(guān)重要。

目前，有研究表明，與其他強(qiáng)酸(如硝酸、鹽酸、甲酸等)相比EDTA-2Na是科研中較理想的脫鈣劑，尤其是免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，而微波-EDTA聯(lián)合脫鈣時(shí)，則可以明顯提高脫鈣速度[2,4,10]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，超聲振動(dòng)可加增加相互碰撞機(jī)會(huì)，提高分子平均能量，加劇分子運(yùn)動(dòng)降低反應(yīng)活化能，從而提高化學(xué)反應(yīng)速度，甚至改變化學(xué)反應(yīng)機(jī)理，啟動(dòng)新的反應(yīng)渠道[5-6]。使用超聲波對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣，也可取得較好的脫鈣效果[7-8]。但超聲用于免疫組化實(shí)驗(yàn)中牙齒脫鈣的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究中，用EDTA脫鈣液，采用微波、超聲、微波-超聲聯(lián)合及常溫下對(duì)牙體組織的脫鈣情況以及不同脫鈣方法對(duì)免疫組化染色的影響程度進(jìn)行了比較。對(duì)兩種抗體的檢測(cè)結(jié)果均表明：在四種脫鈣方法中微波-超聲聯(lián)合組脫鈣效果最好，免疫組化染色效果最佳。其原因可能是因?yàn)樵谖⒉姶艌?chǎng)作用下，使脫鈣組織中排列混亂的極性分子快速轉(zhuǎn)向，并定向排列，在運(yùn)動(dòng)、摩擦、碰撞過程中產(chǎn)熱使脫鈣速度加快；超聲輻射所產(chǎn)生的能量可以使反應(yīng)體系破碎、分散、霧化混合,增加反應(yīng)界面，打開化學(xué)鍵，反應(yīng)的進(jìn)行同時(shí)也可引起加熱效應(yīng)等來促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。另外超聲波的作用使絡(luò)合產(chǎn)物和中間體及時(shí)離開反應(yīng)界面，類似高效的機(jī)械攪拌[9]。因此可能是當(dāng)微波-超聲聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，通過超聲將牙體表面磷酸鈣晶體溶解，形成EDTA-2Na和鈣的螯合物，超聲振動(dòng)，將牙體表面鈣團(tuán)洗脫，打開更多通道與脫鈣液接觸，進(jìn)而更加利于微波脫鈣，從而使脫鈣時(shí)間縮短。另外分析可能是因?yàn)镋DTA-2Na有萃取某些基質(zhì)蛋白的作用[11],常溫組脫鈣時(shí)間過長(zhǎng)降低了抗原的免疫反應(yīng)性。而微波組和超聲組可能是由于在脫鈣時(shí)間上沒有明顯的差別，因此其免疫組化染色強(qiáng)度無顯著差異（P＞0.05）。微波-超聲聯(lián)合組由于脫鈣時(shí)間的縮短，減輕了脫鈣液對(duì)脫鈣組織的破壞，使組織中的抗原以及細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)得到了較好的保護(hù)，因此免疫組化染色更強(qiáng)。并且，可能是因?yàn)樵摲撯}更為均勻徹底[3]，更進(jìn)一步提高了制片的質(zhì)量。

總之，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采用微波-超聲聯(lián)合脫鈣，且注意實(shí)驗(yàn)中各環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化操作，可縮短脫鈣時(shí)間，獲得較滿意的染色效果，提高制片質(zhì)量。但本實(shí)驗(yàn)中僅對(duì)Ⅰ型膠原蛋白、FN兩種抗體的某一選定濃度進(jìn)行了檢測(cè)，尚未對(duì)其它濃度及更多抗原進(jìn)行測(cè)定，仍存在不足之處，對(duì)微波-超聲聯(lián)合法脫鈣的化學(xué)反應(yīng)機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2012-02-21 [修回日期]2012-04-13

編輯/張惠娟