活血消癭方對(duì)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫模型大鼠甲狀腺細(xì)胞增殖和凋亡的影響

涂曉坤，指導(dǎo)：陳如泉

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061)

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫是一種常見的甲狀腺病癥，長(zhǎng)期甲狀腺腫最終都會(huì)發(fā)展為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，如果用超聲或手術(shù)病理檢查，幾乎絕大多數(shù)臨床診斷的彌漫性甲狀腺腫在超聲檢查中都被發(fā)現(xiàn)為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。其在人群中的發(fā)病率為4.0%～7.0%?；颊咧信远嘤谀行?，患病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，大多數(shù)為良性病變，惡性率低于5%[1]。目前,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的門診患者流量急劇增加，關(guān)于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的臨床及實(shí)驗(yàn)研究也日益受到重視。對(duì)于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫西醫(yī)保守治療主要選用甲狀腺激素抑制性治療，雖然能使某些甲狀腺腫的彌慢性增大部分縮小但對(duì)腺體本身作用較小，而且毒副作用大，劑量不易掌握。部分病例主張?jiān)缙谑中g(shù)切除，但手術(shù)治療有復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多等缺點(diǎn)，病人常難以接受。中醫(yī)并沒有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫之病名，根據(jù)本病的主要臨床表現(xiàn)一般將其類屬于“癭瘤”的范疇?；钛`方是陳如泉教授臨床治療甲狀腺腫的經(jīng)驗(yàn)方，已有臨床研究[2]顯示活血消癭方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫作用優(yōu)于優(yōu)甲樂，具有肯定的臨床療效及安全性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑 丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)，深圳市中聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)；左旋甲狀腺素片(levothyroxine，L-T4)，默克公司生產(chǎn)；PCNA檢測(cè)試劑盒，由武漢博士德公司提供；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒，由abcam公司提供。

活血消癭方煎煮液:該方由蜣螂蟲10 g，土鱉蟲10 g，蜈蚣5 g，莪術(shù)10 g，王不留行10 g，桃仁10 g，貓爪草10 g，柴胡10 g組成。以上生藥均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診部藥房提供。將上藥放在干凈的玻璃杯中加水500 mL浸泡30 min，然后于100 ℃煎煮至500 mL，過濾藥渣后得濾液300 mL，再將藥渣加入400 mL純水繼續(xù)煎至300 mL,合并2次煎煮液，分別稀釋至0.264 g/mL、0.132 g/mL、0.066 g/mL。

1.2 儀器 DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；Epson Perfection V300 Photo掃描儀，Epson公司；752-P紫外可見光分光光度計(jì)，上海現(xiàn)科儀器有限公司。BD-FACS Calibur流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.3 動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量150 g左右，由武漢病毒研究所提供。

2 方法

2.1 分組方法 取Wistar大鼠30只，隨機(jī)分成6組，每組各5只，即正常組、模型組、L-T4組、小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組和大劑量活血消癭方組。

2.2 造模方法 參照Tamura的方法[3]造模。用生理鹽水配成0.1%的PTU溶液,每只大鼠每天按100 mg/kg 體質(zhì)量連續(xù)灌服8周。甲狀腺彩超發(fā)現(xiàn)大鼠甲狀腺腫塊,即為造模成功。

2.3 處理方法 正常組灌服生理鹽水，其余5組，即模型組、L-T4組、小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組和大劑量活血消癭方組行造模處理。同時(shí)L-T4組大鼠每天按100 mg/kg體質(zhì)量灌服L-T4。小劑量活血消癭方組、中劑量活血消癭方組、大劑量活血消癭方組大鼠每天分別按0.44 g/kg體質(zhì)量、0.88 g/kg 體質(zhì)量、1.76 g/kg體質(zhì)量灌服活血消癭方。

2.4 取材和指標(biāo)檢測(cè) 于8周后處死大鼠，取大鼠雙側(cè)甲狀腺，保存于-20 ℃。1)采用Western Blot法檢測(cè)PCNA在大鼠甲狀腺組織中的表達(dá)，結(jié)果以AlphaEase FC軟件取值，計(jì)算標(biāo)本灰度值；2)采用流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)大鼠甲狀腺腫組織中的細(xì)胞凋亡水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠甲狀腺組織中PCNA的表達(dá) 見表1。

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細(xì)胞中的表達(dá)(±s)

3.2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡水平 見表2。

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細(xì)胞比例(±s) %

4 討論

活血消癭方由蜣螂蟲、土鱉蟲、蜈蚣、莪術(shù)、王不留行、桃仁、貓爪草、柴胡等組成。蜣螂蟲為方中之君藥，主活血化瘀。土鱉蟲具有散血瘀、消堅(jiān)結(jié)、解凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效。蜈蚣具有熄風(fēng)止痙，解毒散結(jié)，通絡(luò)止痛的作用。土鱉蟲、蜈蚣2味，共達(dá)活血消癭之效，為方中臣藥。因搜剔經(jīng)絡(luò)之風(fēng)、濕、痰、瘀，莫如蟲類，絡(luò)道疏通，氣血暢流，頑痹方能緩解，處方中用蟲藥以達(dá)逐風(fēng)、活血、化瘀、祛痰之目的。莪術(shù)功效行氣破血、消積止痛。王不留行功效活血通經(jīng)、下乳消腫、利水通淋。桃仁功效活血祛瘀、潤(rùn)腸通便。貓爪草具有清熱解毒、軟堅(jiān)化痰、散結(jié)消腫等多方面的功效。莪術(shù)、桃仁、王不留行、貓爪草配伍，共化癭病之痰血瘀阻，為方中佐藥。柴胡功效解表退熱、截瘧、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣，為方中使藥。全方藥物配伍共奏活血化痰、消癭化結(jié)之效。

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為[4]可能與甲狀腺細(xì)胞的增殖和凋亡失去平衡有關(guān)。目前己發(fā)現(xiàn)有多種評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指標(biāo)之一。PCNA是一種分子量為36 KD的蛋白質(zhì),在細(xì)胞核內(nèi)合成，并存在于細(xì)胞核內(nèi)，為脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)聚合酶6的輔助蛋白，由于其在DNA復(fù)制和修復(fù)中的重要功能，已廣泛作為反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)[5]。在細(xì)胞核內(nèi)存在可溶性與不溶性2種PCNA,可溶性PCNA在細(xì)胞周期各期中均有表達(dá),其量在DNA合成過程中不發(fā)生明顯變化,易被去污劑提取、甲醇破壞；不溶性PCNA較穩(wěn)定，不易被去污劑洗脫、甲醇破壞，這種PCNA在G0-G1期細(xì)胞中無明顯表達(dá),G1晚期，其表達(dá)大幅度增加,S期達(dá)到高峰，G2-M期明顯下降，其量的變化與DNA合成一致，一般作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)[6]。臨床研究[7]已經(jīng)證明PCNA的表達(dá)在甲狀腺腫組織中顯著增強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)性大鼠甲狀腺腫模型中，PCNA較正常對(duì)照組相比，表達(dá)明顯增強(qiáng)，在撤掉致甲狀腺腫因素后，隨著甲狀腺重量的減輕，PCNA的表達(dá)也逐漸減弱[8]，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相符。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的磷脂酰絲氨酸外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。另外，Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。結(jié)果與細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚未明了。趙明等[9]的研究發(fā)現(xiàn)與正常甲狀腺濾泡細(xì)胞相比，非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫甲狀腺濾泡細(xì)胞含有較多的凋亡小體，兩者有顯著性差異，提示非毒性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)病機(jī)理和甲狀腺濾泡細(xì)胞的凋亡有密切的關(guān)系，也與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

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