HPLC-MS法對(duì)通頂散中人參藜蘆相反相用物質(zhì)基礎(chǔ)研究

孫佳明，李 娜，張艷平，宮 爽，賈雪婷，張 輝

(長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林 長春 130021)

通頂散源于明代名醫(yī)吳鶴皋所著《醫(yī)方考》，方由藜蘆、人參、川芎、細(xì)辛、石膏、甘草組成，主治“中風(fēng)不省人事，病已極矣，非平藥可以開其壅塞”，以藜蘆與人參、細(xì)辛共用，取其相反而相用也。藜蘆總生物堿具有明顯而持久的降壓作用，臨床上多用于治療腦卒中不語[1]。有報(bào)道[2]稱人參與有毒藜蘆配伍，有毒性降低的結(jié)果，因此有必要結(jié)合毒理學(xué)方法應(yīng)用現(xiàn)代高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)“通頂散”中“人參-藜蘆”相反相用的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥物 藜蘆、人參、川芎、細(xì)辛、石膏和甘草購自吉林省長春市吉林大藥房；試驗(yàn)所用的通頂散和去人參樣品水煎液由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心提供。

1.2 儀器 Agilent 1100 series LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，包括：Agilent SL型多級(jí)離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、Chemistation化學(xué)工作站等；GL-20G-H型低溫超速離心機(jī)；BP211D型十萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.3 試劑 乙腈、甲醇和甲酸為色譜純(Fisher公司生產(chǎn))；水為超純水(Milli-Q)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 通頂散及其去人參樣品水煎液的制備 各自將藜蘆1 g，人參1 g，川芎1 g，細(xì)辛1 g，石膏5 g，甘草1 g(均為粗粉)混合，首次加10倍量水浸泡20 min，微沸提取40 min,第2煎加入8倍量水，微沸提取20 min，合并2次濾液，濃縮，得到通頂散水煎液；將藜蘆1 g，川芎1 g，細(xì)辛1 g，石膏5 g，甘草1 g(均為粗粉)混合，同法制得去人參樣品水煎液，供急毒測(cè)試用。將以上制備的煎液靜置，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存，供液質(zhì)分析用。

1.4.2 色譜質(zhì)譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：甲醇/0.1%的甲酸水溶液二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相梯度設(shè)置(見表1)。流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度表

電噴霧離子源(ESI)；正、負(fù)離子同時(shí)采集；掃描范圍：50～1 200 Da；目標(biāo)分子量：500；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；霧化氣壓強(qiáng)：0.24 MPa；毛細(xì)管電壓：4 kV。

2 結(jié)果和討論

2.1 通頂散及其去人參樣品水煎液中化學(xué)成分的色譜研究 結(jié)果表明,甲醇0.1%的甲酸水溶液二元線性梯度洗脫，通頂散及其去人參樣品水煎液中化學(xué)成分得到了較理想的分離效果。

2.2 通頂散及其去人參樣品水煎液中化學(xué)成分的高效液相色譜與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用研究 采用HPLC-DAD-ESI-MS2聯(lián)用技術(shù),根據(jù)藜蘆生物堿類化學(xué)成分的色譜保留時(shí)間、紫外吸收特征、準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，并參考文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行解析，鑒定了通頂散及其去人參樣品水煎液中共有的9個(gè)藜蘆生物堿類化學(xué)成分的可能結(jié)構(gòu)。由于通頂散及其去人參樣品水煎液中的每個(gè)對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間、紫外吸收特征、準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息均基本相同，因此每個(gè)色譜峰的峰面積的變化可以反映對(duì)應(yīng)化合物含量的變化。對(duì)通頂散水煎液中各色譜峰的峰面積與去人參樣品水煎液中對(duì)應(yīng)的色譜峰的峰面積進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)通頂散水煎液中藜蘆生物堿的種類和數(shù)量并未產(chǎn)生變化。但除了偽介芬胺和藜蘆酰棋盤花胺的峰面積有所增加外，其余色譜峰的峰面積均有不同程度的減少，這說明通頂散中其他生物堿化學(xué)成分含量相對(duì)于去人參樣品水煎液均有不同程度的下降。尤其是介芬胺的含量下降尤為明顯，僅為去人參樣品水煎液的26.2%，其他生物堿成分含量下降到去人參樣品的34.4%～97.9%不等。通頂散及其去人參樣品水煎液中9個(gè)共有成分的對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積的變化和HPLC-DAD-ESI-MS2分析結(jié)果見表2。

表2 通頂散及其去人參樣品水煎液中共有藜蘆類生物堿成分正離子掃描模式的HPLC-DAD-ESI-MS2分析結(jié)果

3 討論

通過通頂散及其去人參樣品水煎液的毒性比較，前者的小鼠口服LD50明顯高于后者，說明當(dāng)通頂散中去掉人參僅余一個(gè)相反藥對(duì)“細(xì)辛-藜蘆”時(shí)，其毒性明顯增強(qiáng)。結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)二者所含藜蘆生物堿類成分的種類和數(shù)量基本一致，但是通頂散中多數(shù)藜蘆生物堿類化學(xué)成分含量相對(duì)于去人參樣品水煎液均有不同程度的下降，尤其是介芬胺的含量下降尤為明顯，說明通頂散的去人參樣品產(chǎn)生毒性反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)系藜蘆類生物堿。而且文獻(xiàn)報(bào)道藜蘆類生物堿多數(shù)具有強(qiáng)烈的毒性，例如芥芬胺給小鼠靜注的LD50為9.3 mg/kg，為劇毒類生物堿。正是這些具有強(qiáng)烈毒性的藜蘆類生物堿成分在通頂散中兩個(gè)相反藥對(duì)共用的情況下，減少成分溶出，又保留了一定的含量，從而起到了減小毒性，保證療效的作用。本研究結(jié)果對(duì)通頂散的傳統(tǒng)功效與“十八反”基礎(chǔ)理論有機(jī)結(jié)合的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵的研究有一定借鑒的意義。

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