靜力負荷對大鼠骨骼肌線粒體及肌漿網(wǎng)功能的影響

王燦，楊成君，尹忠偉

(1.沈陽醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學教研室，遼寧沈陽110034;2.沈陽軍區(qū)疾病預防控制中心)

隨著科學技術的進步，生產(chǎn)力的發(fā)展，生產(chǎn)勞動中自動化、機械化的程度越來越高，有越來越多的作業(yè)要求勞動者長期維持某種固定作業(yè)體位，靜力負荷所致肌肉損傷的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。在一些工業(yè)化國家已成為主要的職業(yè)健康問題，歐美等國已將其列入職業(yè)病范疇。在我國職業(yè)性肌肉骨骼損傷也日益嚴重，有調查顯示黃石市冶金、建筑、紡織3種行業(yè)中主要作業(yè)工人肌肉骨骼疾患的總患病率為87.32%［1］，一些調查顯示在鑄造行業(yè)，下背痛患病率為88.40%;焊接工下背痛患病率為41.55%［2］。因此，研究靜力負荷所致肌肉損傷的機制具有重要意義。目前研究認為細胞內鈣失衡、自由基產(chǎn)生、能量代謝等因素是長期靜力負荷致骨骼肌損傷的主要機制，通過觀察Ca2+、Ca2+-ATPase、丙二醛 (malondialchehyche，MDA)在骨骼肌線粒體與肌漿網(wǎng)中的變化，探討靜力負荷致骨骼肌損傷的機制，為此我們開展了本次研究。

1 實驗動物和方法

1.1 實驗動物及分組 實驗動物由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號:SYXK(遼)2010-0002。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食進水，室溫20～22℃，相對濕度50% ～60%，自動控制器進行空氣調節(jié)，飼養(yǎng)1周后進行實驗。選取16只雄性Wistar大鼠，體重200～220 g，隨機分為對照組、負荷組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 動物處理方法 用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠四肢固定在解剖板上，剪開左下肢皮膚，游離比目魚肌遠端，施加100 g負荷，將大鼠上肢固定在高60 cm的鐵架上，負荷90 min，對照組以同樣的方式處理，只是不施加負荷 (圖1)。

圖1 左下肢比目魚肌施加100 g負荷90 min的大鼠

1.2.2 大鼠比目魚肌線粒體及肌漿網(wǎng)的制備 線粒體懸液的制備:負荷實驗結束后取出部分比目魚肌，在4℃生理鹽水中漂洗除去血液，用試紙擦干，稱重，放入10 ml小燒杯內，加入9倍于組織塊重量的生理鹽水，將組織塊剪碎，用玻璃勻漿器，手工勻漿8 min，將勻漿液3 000r/min離心10 min，留上清得10%組織勻漿液。取10%的組織勻漿液，9 000 r/min離心20 min，沉淀物為線粒體。將得到的線粒體沉淀加生理鹽水2 m l，用玻璃勻漿器，手工勻漿8 min，得到破碎的線粒體懸液，待測。分離出線粒體后的骨骼肌胞漿液經(jīng)40 000 r/min，離心15 min，得到肌漿網(wǎng)沉淀。取下層沉淀的肌漿網(wǎng)，加1 m l4℃生理鹽水，研磨6～8 min，制成肌漿網(wǎng)懸浮液，待測，整個處理過程在1～4℃條件下完成。

1.2.3 生化指標測定方法 (1)鈣濃度測定:取待測樣品0.1 m l于10 ml清潔小燒杯中，加5 m l濃硝酸 (分析純)消化24 h，于自控電熱消化吸收器中 (120℃)揮發(fā)至溶液無色，在原子吸收分光光度計上測定659 nm處吸光度值，并計算鈣含量，以每克蛋白水平 (μmol/g)表示。蛋白定量采用南京建成生物研究所提供的考馬斯亮藍顯色劑測定;(2)Ca2+-ATPase測定:取0.2 ml線粒體懸液，采用南京建成生物研究所提供的試劑盒測定。通過酶促水解ATP生成無機磷的水平來表示酶的活力，以mmol/g表示 (試劑盒說明書上定義:規(guī)定每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位。即每小時每微摩爾分子磷/毫克蛋白);(3)MDA水平測定:取0.2 ml待測液，MDA采用南京建城生物研究所提供試劑盒測定。其原理是過氧化脂質降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸光度。結果以每克蛋白表示 (μmol/g)。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗;結果用±s表示;P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 大鼠骨骼肌線粒體生化指標的變化 負荷組與對照組相比，線粒體Ca2+濃度增加111.11%(t=3.201，P=0.006);Ca2+-ATPase活力下降25.88%(t=3.047，P=0.009);MDA含量增加188.57%(t=7.619，P=0.000)，見表1。

表1 兩組大鼠骨骼肌線粒體Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比較 (n=8，±s)

表1 兩組大鼠骨骼肌線粒體Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比較 (n=8，±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01

組別 Ca(μmol/g) Ca-ATPase(mmol/g) MDA(μmol/g)對照組1.62±0.64 22.41±4.20 2.45±0.70負荷組 3.42±1.461) 16.61±3.361) 7.07±1.561)

2.2 大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)生化指標的變化 負荷組與對照組相比較，骨骼肌肌漿網(wǎng) Ca2+濃度下降75.89%(t=7.152，P=0.000);Ca2+-ATPase活力下降61.49%(t=7.913，P=0.000);MDA含量增加122.86%(t=8.012，P=0.000)，見表2。

表2 兩組大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比較 (n=8，±s)

表2 兩組大鼠骨骼肌肌漿網(wǎng)Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比較 (n=8，±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01

組別 Ca2+(μmol/g) Ca2+-ATPase(mmol/g) MDA(μmol/g)對照組2.24±0.63 4.70±0.81 4.55±1.29負荷組 0.54±0.231) 1.81±0.641) 10.14±1.501)

3 討論

細胞質中Ca2+濃度的變化調節(jié)著細胞許多基本生理功能，對于靜息狀態(tài)肌細胞，30%的鈣貯存于線粒體中，14%存在于肌漿網(wǎng)，由于線粒體和肌漿網(wǎng)中鈣量比細胞質高出幾百倍，常把這兩種亞細胞結構視為細胞鈣庫。線粒體和肌漿網(wǎng)調控著 Ca2+的轉運，對維持胞質 Ca2+濃度極低(0.1微克分子)的穩(wěn)態(tài)起重要意義［3］。骨骼肌線粒體是細胞的呼吸器官，是細胞能量代謝的中心，細胞生命活動所需能量約95%由線粒體通過電子傳遞鏈反應，它通過氧化磷酸化生成ATP供給細胞需要［4］。線粒體又是細胞Ca2+的緩沖器，具有攝取、釋放Ca2+以及調節(jié)胞漿Ca2+濃度的能力。它通過鈣的攝取與釋放調節(jié)鈣含量，以維持細胞的功能。線粒體又是對缺氧最敏感的細胞器。有研究顯示骨骼肌長期處于靜力負荷下，會引起局部肌肉緊張度增加，壓迫血管，導致肌肉血液供應不足和供氧不足、ATP減少、代謝物不斷堆積及自由基增多等方面的變化。本實驗對大鼠比目魚肌施加100 g靜力負荷，90 min后，負荷組與對照組比較，線粒體Ca2+濃度升高111.11%、Ca2+-ATPase活性下降25.88%、MDA升高188.57%，差異有顯著性。其原因一是可能與骨骼肌長時間收縮產(chǎn)生的機械牽拉，使細胞外的Ca2+通過細胞膜上的牽拉性Ca2+通道進入肌細胞。二是長時間負荷作用于骨骼肌，胞漿Ca2+濃度會應激性增加，不能維持胞漿內低鈣水平，線粒體依靠耗能的內流機制攝取Ca2+以緩沖胞漿中Ca2+的過度增加，造成線粒體Ca2+超載，線粒體內Ca2+濃度的增加，抑制了自身氧化磷酸化過程，減少ATP生成。同時，缺血缺氧使肌肉無氧酵解增強，引發(fā)脂質過氧化反應，其產(chǎn)物MDA和自由基均可對膜系統(tǒng)造成攻擊，膜損傷的后果是氧化磷酸化解偶聯(lián)，ATP生成減少，鈣泵酶活力降低，ATP生成減少使細胞能量代謝受到障礙。線粒體內Ca2+增高，Ca2+-ATPase活力下降和MDA增多，三者共同影響著線粒體正常功能，成為骨骼肌細胞損傷的機制之一。此結果與何麗華等對家兔實施靜力負荷研究結果相同［5］。

肌漿網(wǎng)是骨骼肌調節(jié)細胞Ca2+濃度的生要的細胞器之一，在肌肉興奮－收縮偶聯(lián)過程中起關鍵作用。靜息時胞漿內游離Ca2+濃度極低，肌肉處于松馳狀態(tài);肌肉興奮時，肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，通過一系列反應引起肌纖維收縮;興奮停止后肌漿網(wǎng)通過鈣泵消耗能量，將Ca2+重新攝入肌漿網(wǎng)。骨骼肌在長時間負荷作用下，代謝物堆積及自由基的產(chǎn)生，能量的消耗，使肌漿網(wǎng)攝入Ca2+能力下降。本實驗結果，負荷組與對照組比較，肌漿網(wǎng)Ca2+濃度下降75.89%，Ca2+-ATPase活力下降61.49%，MDA含量增加122.86%。肌漿網(wǎng)攝鈣能力下降可能與Ca2+-ATPase活力下降、MDA增加、ATP的消耗有關。由于肌漿網(wǎng)攝取Ca2+能力下降，造成胞漿Ca2+平衡紊亂，加重線粒體鈣超載，可能成為骨骼肌細胞損傷的主要原因之一。本結果與王翔等［6］、王生等［7］的研究結果相一致。實驗結果表明，長時間靜力負荷作用于機體局部，引起的骨骼肌損傷與骨骼肌線粒體鈣超載和肌漿網(wǎng)攝鈣能力下降、肌漿網(wǎng)、線粒體膜Ca2+-ATPase活力下降、MDA增多有關。

［1］張俐娜，張紅娣，萬松泉，等.三種行業(yè)工人職業(yè)性肌肉骨骼疾患調查分析 ［J］.公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學，2006，17(2):47－48.

［2］白璐，王建新，岳朋朋.職業(yè)性肌肉骨骼疾患研究現(xiàn)狀 ［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2009，22(5):356－359.

［3］宋今丹.醫(yī)學細胞生物學 ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:143－157.

［4］劉曄.骨骼肌靜力性負荷所致?lián)p傷機理的研究［M］.北京:北京體育大學出版社，2010:12.

［5］何麗華，王生，鄭強，等.靜態(tài)負荷致骨骼肌損傷中線粒體功能的變化 ［J］.中國職業(yè)醫(yī)學，2001，28(2):2－4.

［6］王翔，魏源.力竭運動后大鼠骨骼肌不同肌纖維線粒體鈣含量和肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活力變化 ［J］.浙江體育科學，2002，24(2):50－52.

［7］王生，鄭強，何麗華，等.靜態(tài)負荷對家兔骨骼肌胞漿Ca2+含量及肌漿網(wǎng)功能的影響 ［J］.中華勞動衛(wèi)生雜志，2000，18(6):327－329.