超高效液相色譜法測(cè)定人體血漿中水楊酸含量的方法學(xué)研究

董曉茜，夏素霞*，邢天舒，唐思，張世良，王月敏

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)門診部)

鋁鎂司片主要成分阿司匹林。由于阿司匹林口服后在體內(nèi)很快轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物水楊酸，故在進(jìn)行阿司匹林的血藥濃度研究時(shí)大多測(cè)定血漿中水楊酸的濃度［1］。根據(jù)文獻(xiàn)［2－4］，人體血漿中水楊酸的測(cè)定的方法包括HPLC、LC-MS/MS、GC-MS等，考慮到HPLC法保留時(shí)間長(zhǎng)，LC-MS/MS重復(fù)性不好，GC-MS操作繁瑣。本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜 (ultra performance liquid chromatography，UPLC)法測(cè)定主要代謝產(chǎn)物水楊酸經(jīng)時(shí)血藥濃度，為進(jìn)一步完成藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)提供可靠的依據(jù)。

1 藥品、試劑與儀器

鋁鎂司片，規(guī)格:每片中含阿司匹林81 mg、重質(zhì)碳酸鎂22 mg、甘羥鋁11 mg;給藥途徑:口服;水楊酸對(duì)照品 (批號(hào):100106-200303)、非那西丁對(duì)照品 (批號(hào):100095-198904)為內(nèi)標(biāo)(中國(guó)藥品生物檢定所)。乙腈為色譜純 (德國(guó)Merck公司);冰醋酸為色譜純 (美國(guó) Tedia公司)，甲基叔丁基醚為分析純 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為屈臣氏蒸餾水。

WASTERSACQUITY UPLCTMTUV型超高效液相，EMPOWERTM2 software數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) (美國(guó)沃特世公司);XW-80A微型旋渦混合儀 (上海滬西分析儀器廠);XS105分析天平 (梅特勒－托利多儀器有限公司);SIGMA3-18k低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 取血方法

2.1.1 受試者選擇 健康志愿者30人，男女各半，年齡19～28歲，平均年齡 (22.90±2.35)歲;體重指數(shù)為19.1～23.7 kg/m2，平均 (20.91±1.52)kg/m2;所有受試者均無藥物過敏史，無煙嗜好。試驗(yàn)前所有受試者的血壓、脈搏等生命特征檢查、心電圖檢查及血、尿常規(guī)和肝、腎功能等檢查，均在正常值范圍。試驗(yàn)前二周至試驗(yàn)結(jié)束前停用任何其他藥物。受試者試驗(yàn)前應(yīng)簽署知情同意書。本試驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批后通過。

2.1.2 血樣采集 30名受試者每組各10人，于試驗(yàn)前1日和試驗(yàn)期間均勿飲用酒類、咖啡類飲料和果汁;受試者禁食10 h后，次日早上口服給藥，低、中、高三個(gè)劑量組受試者分別口服試驗(yàn)制劑1粒、2粒、4粒，同一劑量組的每個(gè)受試者給藥時(shí)間間隔5 min，抽血時(shí)間間隔5 min。中劑量組受試者完成單次給藥試驗(yàn)后，第2天早上進(jìn)行多次給藥試驗(yàn) (以單次給藥試驗(yàn)當(dāng)天為多次給藥的第1 d)。多次給藥7 d，每天1次，每次口服試驗(yàn)制劑2粒，第4、5、6天早上用藥前采集血樣測(cè)谷濃度以確定達(dá)穩(wěn)態(tài)濃度的時(shí)間。第7天早上用藥后按照單次給藥的采血時(shí)間點(diǎn)采集血樣。用藥后2 h方能飲水，4，10 h后可進(jìn)食統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)餐。受試者用藥后應(yīng)避免劇烈活動(dòng)，亦不得長(zhǎng)時(shí)間臥床。分別于服藥前 (0 h)和給藥后5、10、20、30、45、60 min，1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h采集肘靜脈血4 ml，置于肝素化的試管中，試管置于冰水浴中，4℃，3 000 rpm離心10 min后分離血漿置－70℃冰箱備用，待測(cè)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取水楊酸對(duì)照品11.28mg，置于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1 128mg/L的水楊酸儲(chǔ)備液，用前稀釋為應(yīng)用液。精密稱取非那西丁對(duì)照品14.20 mg，置于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為1 420 mg/L的非那西丁儲(chǔ)備液，精密量取儲(chǔ)備液4 ml，于10 ml容量瓶中，以乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為568 mg/L的非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 樣品預(yù)處理 精密量取血漿200μl置于離心管中，精密加入非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液 (568 mg/L)10μl，渦旋30 s，加入1%鹽酸80μl，渦旋30 s，精密加入甲基叔丁基醚1 m l，渦旋2 min，14 000 rpm離心10 min，取上清液800μl，室溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl流動(dòng)相溶解殘?jiān)?4 000 rpm離心10 min，取上清液5μl進(jìn)樣。

2.4 色譜條件 色譜柱:Waters Spursil C18(100 mm×2.10 mm，3μm);流動(dòng)相:乙腈∶水 (含0.2%磷酸)=20.7∶79.3;波長(zhǎng):304 nm;流速:0.3 ml/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:5μl。

2.5 方法的專屬性 精密取6份不同來源空白混合血漿200μl，按“2.2”項(xiàng)下自“渦旋30 s”起同法操作，得色譜圖1-A;將濃度56.400 mg/L水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血漿中配制成相當(dāng)于2.820 mg/L的含藥血漿中，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，得色譜圖1-B;取受試者9號(hào)給鋁鎂司片81 mg后1.5 h收集的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，得色譜圖1-C。水楊酸保留時(shí)間為4.7 min左右;內(nèi)標(biāo)非那西丁的保留時(shí)間為3.9 min左右，結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾水楊酸和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 精密量取不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl于7個(gè)空白離心管中，氮?dú)獯蹈?，加?00μl空白血漿，配制成血漿中水楊酸濃度分別為:0.018、0.113、0.564、1.410、5.640、14.100、28.200 mg/L的血漿樣品。按“2.2項(xiàng)下”自“精密加入非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液(568 mg/L)10μl”起操作，進(jìn)樣分析，建立水楊酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度 (Cs)與內(nèi)標(biāo)濃度 (Ci)的比值 (Cs/Ci)為橫坐標(biāo)，以X表示，待測(cè)物峰面積 (As)與內(nèi)標(biāo)峰面積 (Ai)的比值(As/Ai)為縱坐標(biāo)，以Y表示，用加權(quán) (權(quán)重系數(shù):1/X2)進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，得Y=19.9X+0.728，r=0.993。結(jié)果表明水楊酸在0.018～28.200 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.018 mg/L(S/N ＞10)。

2.7 樣品回收率實(shí)驗(yàn) 取空白離心管，分別加入不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μl，氮?dú)獯蹈?，加?00μl空白血漿配制成低、中、高三個(gè)濃度(分別為0.045、2.820和22.560 mg/L)的血漿樣品各3份，再按“2.2”項(xiàng)下操作，5μl進(jìn)樣，得到相應(yīng)的藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積;另取不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μl，加入非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液 (568mg/L)10μl，氮?dú)庀麓蹈桑尤?00μl流動(dòng)相復(fù)溶，配制低、中、高三個(gè)濃度樣品 (分別為0.045、2.820和22.560 mg/L)，10μl進(jìn)樣分析，得到藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積;每一濃度進(jìn)行三樣本分析。結(jié)果見表1，表明水楊酸低、中、高三個(gè)濃度的提取回收率為95.52%～104.63%。

圖1 水楊酸專屬性色譜圖

表1 血漿中水楊酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 按回收率試驗(yàn)配制3個(gè)不同濃度的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下操作，在不同天內(nèi)多次制備并測(cè)定，每批樣品低、中、高三個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度進(jìn)行六樣本分析，計(jì)算得日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (relative standard deviation，RSD)均小于10%(n=6)。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2 ml空白離心管分別加入不同濃度水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl，氮?dú)獯蹈桑偌尤?00μl空白血漿，配制成血漿中藥物濃度分別為0.045和22.560 mg/L的低、高2個(gè)濃度血漿樣品，制備五份 (每份各濃度分別為三個(gè)樣本)，其中三份按“2.2”項(xiàng)下操作，在4℃放置0、13、30 h后進(jìn)樣分析，考察處理后血漿樣品在4℃條件下的穩(wěn)定性;另一份于－70℃冰箱冷凍，待血漿融化后6 h，按“2.2”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，考察血漿樣品的血漿融化后6 h穩(wěn)定性;另一份于－70℃冰箱冷凍，反復(fù)凍融三次后，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析，考察血漿樣品的反復(fù)凍融穩(wěn)定性。

另外將在試驗(yàn)開始配制的藥物濃度分別為0.045和22.560 mg/L的低、高2個(gè)濃度血漿樣品于－70℃冷凍保存3個(gè)月后，進(jìn)樣分析，考察血漿樣品在長(zhǎng)期冷凍條件下的穩(wěn)定性，每份進(jìn)行三樣本分析。結(jié)果表明水楊酸血漿樣品3個(gè)濃度在預(yù)處理后4℃下放置0、13、30 h后、血漿融化6h后、－70℃反復(fù)凍融3次后及在－70℃長(zhǎng)期冷凍3個(gè)月后在本實(shí)驗(yàn)條件下均保持穩(wěn)定且RSD＜15%(n=5)，符合方法學(xué)要求。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次采用此方法測(cè)定其血藥濃度，克服了其他方法的不足，所建方法已用于大樣本的藥物動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究，為合理用藥提供依據(jù)。在本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相條件下，先后用過乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷作為提取溶劑，效果均不太理想。參考文獻(xiàn)［5］，經(jīng)試驗(yàn)確定，加入一定濃度的鹽酸之后，再用甲基叔丁基醚提取，效果很好。實(shí)驗(yàn)以乙腈與水作為流動(dòng)相，磷酸調(diào)節(jié)pH簡(jiǎn)化了流動(dòng)相的配制，且具有良好的分離度，能夠達(dá)到滿意的分離效果

［1］ Seegers JM，Oiling M，Jager LD，et a1.Interactions of aspirin with acetaminophen and afeine in rat stomach pharmacokinetics of absorption and accumulation in gastricmucosa ［J］.JPharm Sci，1980，69:900.

［2］田蕾，黃一玲，華潞，等.鋁鎂匹林片單劑量和多劑量人體藥動(dòng)學(xué)研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2006，15(16):1393－1396.

［3］楊俊毅，蔣學(xué)華，何林，等.阿酚咖片中阿司匹林的相對(duì)生物利用度研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2003，20(4):661－663.

［4］周燕文，陳麗，蘭聰賢.人血漿中水楊酸的測(cè)定及阿司匹林的人體藥代動(dòng)力學(xué)研究 ［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23(5):572－574.

［5］顧潔，杭太俊，陳珺，等.氨酚匹林咖啡因片人體藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性［J］.藥物分析雜志，2007，27(4):486-489.