天然牡蠣殼納米體復(fù)合型骨材料修復(fù)橈骨缺損的研究

李振威,謝麗麗,曹陽,王璐萍,孔令妍,薛恩興,彭磊

(1.浙江溫州醫(yī)學(xué)院臨床系,浙江 溫州 325000;2.浙江溫州醫(yī)學(xué)院附屬二院骨科,浙江 溫州 325000;3.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷中心 ,海南 ?？?570102)

隨著當(dāng)今社會骨創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染率的逐年升高,造成人們骨缺損的現(xiàn)象越來越常見。骨缺損如果范圍較小,骨端可以經(jīng)自身修復(fù)而愈合,但如果骨缺損范圍較大,則不可能自身修復(fù)。自體骨移植被稱為骨移植的金標(biāo)準(zhǔn),但供區(qū)易發(fā)生疼痛和感染等并發(fā)癥(8%～10%);異體骨移植可出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致骨移植失敗;二者骨來源均有限,移植骨的形狀很難與缺損區(qū)的解剖形狀相符,會影響日后的功能。目前臨床上常用的醫(yī)用硫酸鈣可注射型植骨材料 MIIG X3(minimally invasive injectable graft X3,美國WRIGHT公司)已經(jīng)通過眾多成功的動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用證實(shí)生物相容性、骨傳導(dǎo)性良好[1],是一種安全有效的骨移植替代物,但其吸收速度仍稍快于自身骨替代速度[2],且機(jī)械強(qiáng)度仍顯不足,還不適用于大段或承重骨的缺損修復(fù)[3],另外,MIIG X3目前價(jià)格較貴,不利于臨床推廣應(yīng)用。因此 ,有必要開發(fā)新的生物骨替代材料。

我們發(fā)現(xiàn)溫州近海牡蠣殼具有資源豐富,結(jié)構(gòu)致密,強(qiáng)度與皮質(zhì)骨相當(dāng),Currey等[4]測定牡蠣殼的強(qiáng)度數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中牛的皮質(zhì)骨相當(dāng),Mount證實(shí)牡蠣殼的形成是由粒細(xì)胞不斷分泌的無機(jī)鹽堆積而形成的礦物質(zhì)鹽[5],其近納米顆粒的形成與骨沉積有相似的特點(diǎn),顆粒中 CaCO3成分占到95.994%。最早關(guān)于牡蠣作為生物材料的報(bào)道是在1965年,研究表明將其植入小鼠體內(nèi)沒有任何不良反應(yīng)[6]。將牡蠣殼作為新的骨替代材料的原料成為科學(xué)上的可能,將活性天然牡蠣殼和醫(yī)用硫酸鈣可注射型植骨材料復(fù)合制成新型仿生材料,通過將其植入兔橈骨缺損處,對其生物相容性、修復(fù)效果等方面作出評價(jià)。

1 資料與方法

1.1 牡蠣殼復(fù)合型骨材料制備步驟 取溫州樂清灣無污染海域近江牡蠣,除去其內(nèi)容物后留外殼。流水下沖刷清洗 3次,自然條件下風(fēng)干。將風(fēng)干后的牡蠣殼置于 40%乙酸溶液中浸泡 2h,取出后于流水下沖刷 3次,然后置于流水下沖洗24 h。蒸餾水清洗 3次,于自然條件下風(fēng)干。機(jī)械方法將牡蠣殼碾壓成顆粒狀,分別用 40目和 100目過濾篩過濾,得到約0.15 mm大小的牡蠣殼粉末。采用溶液共混法制備:把消磨后的牡蠣殼碳酸鈣粉劑放入乙醇和氯仿中48h進(jìn)行脫脂,再浸泡在雙氧水中進(jìn)行脫蛋白處理,完成好以上的脫抗原處理后將牡蠣殼碳酸鈣粉劑與 MIIG塑形劑按 1∶5混合,固化后期在預(yù)制品表面嵌入成孔材料,并采用熔解成孔材料的方法在預(yù)制品表面形成直徑達(dá) 200～400μm的孔隙,并用排液法測定孔隙率為 40%～50%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物的骨缺損,制作直徑0.5 cm、長度1.0 cm略帶圓餅狀的人工橈骨替代材料。預(yù)制品常規(guī)高溫高壓消毒后備用。把制作好的骨材料進(jìn)行掃描電鏡觀察,證實(shí)誘導(dǎo)新生骨生長的骨材料的基礎(chǔ)性能:骨板交通及近納米顆粒的組成 (見圖1)。

圖1 牡蠣殼復(fù)合型骨材料的制備過程

1.2 牡蠣殼復(fù)合型骨材料體內(nèi)生物相容性試驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及動物模型 將制備完成的骨材料在生物力學(xué)測試機(jī)上進(jìn)行抗壓力、抗剪力和抗扭力等檢測。選擇36只日本健康成年純種大耳白兔作為實(shí)驗(yàn)動物,體質(zhì)量為 2.5～3.3 kg,將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成 A、B、C三組 (每組 12只),使用 0.1 g/mL水合氯醛 4 mL/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉 ,手術(shù)制備出雙側(cè)橈骨骨缺損模型,橈骨骨缺損大小為1.0cm;A組植入取自髂骨的自體骨,為對照組 1,B組植入MIIG人工骨,為對照組 2,C組植入相同大小牡蠣殼人工骨,為實(shí)驗(yàn)組,術(shù)后予以抗感染治療,分別在第2、4、8、12周末時(shí)隨機(jī)處死動物,每組每批處死 3只(A、B組左側(cè)橈骨為實(shí)驗(yàn)對象,C組右側(cè)橈骨為實(shí)驗(yàn)對象)。

1.2.2 體內(nèi)生物相容性檢測 觀察收集動物術(shù)后飲食、活動、手術(shù)切口愈合情況及植入骨材料周圍組織生長結(jié)合情況等資料。通過X線攝片觀察兔橈骨中段骨材料植入?yún)^(qū)和骨組織結(jié)合情況,材料周圍骨質(zhì)密度及鈣化情況。分別對三組進(jìn)行組織學(xué)檢測,通過 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組 1、2植入?yún)^(qū)新骨形成、骨愈合、生物相容性等情況。

1.2.3 生物力學(xué)檢測 術(shù)后12周,常溫常壓下,取三組各3只兔,處死后取出雙側(cè)橈骨,一起用 IN STRON生物力學(xué)測試系統(tǒng)進(jìn)行三點(diǎn)抗彎強(qiáng)度測試,跨距40mm,加載速度5mm/min,應(yīng)力下降 50%～60%停止加載 ,比較三組橈骨的抗彎曲強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 掃描電鏡觀察骨材料交通 牡蠣殼體骨材料是由直徑在 100～300nm的近納米顆粒成團(tuán)簇狀構(gòu)成,其團(tuán)簇結(jié)構(gòu)成肉眼無規(guī)則形式。其表面上不規(guī)則地排列著直徑在200～400 μm的孔洞,這些孔洞是由不規(guī)則的片狀層構(gòu)成。骨材料板間有相互溝通的管道系統(tǒng)相聯(lián)系,最寬的管道達(dá) 600 nm,平均在 300 nm之間,這和人體骨的骨板、哈佛氏管與浮克曼管的數(shù)量、密度、形狀、孔徑、走向規(guī)律相類似。骨材料板狀體是不規(guī)則排列的,主要以橫、縱兩個(gè)方向排列為主。從結(jié)構(gòu)力學(xué)的角度上來說,這種結(jié)構(gòu)具有很大的穩(wěn)定性,既可以抗壓又可以抗拉,強(qiáng)化了整體的結(jié)構(gòu)(見圖2)。

2.2 牡蠣殼復(fù)合型骨材料體內(nèi)生物相容性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 大體標(biāo)本及X線攝片結(jié)果(A組自體骨組、B組MIIG組、C組牡蠣殼復(fù)合型骨材料組) 術(shù)后動物飲食良好,活動正常。術(shù)后1～3 d步態(tài)不穩(wěn),以后逐漸恢復(fù)正常。傷口愈合良好,無一例感染或積液,不用拆線,線結(jié)10 d左右自行脫落,無化膿、感染,無意外死亡。

植入后 2周,術(shù)區(qū)傷口愈合,僅縫線處有輕微紅腫。A、B、C組在橈骨植入床中有輕微的松動、但無塌陷,表面被骨膜完整包裹,包裹 C組骨材料的骨膜及軟組織無壞死和積液,表面的孔隙中充滿未完全機(jī)化的血凝塊及肉芽組織,A、B組則較少。 X線攝片,骨材料與自體骨組織均為高密度影,B、C組植入?yún)^(qū)內(nèi)骨材料的密度低于周邊正常骨組織。材料與橈骨缺損之間邊界清晰,移植區(qū)投射分界影像明顯,未見明顯的骨修復(fù)跡象。

圖2 骨材料孔洞、骨板交通、近納米顆粒結(jié)構(gòu)

植入后 4周,B、C組骨材料在植入床內(nèi)無移位及松動,C組術(shù)區(qū)表面軟組織膜包裹完整,結(jié)締組織較2周時(shí)密度明顯增加,骨材料外側(cè)可見粉紅色的肉芽軟組織釘突長入骨材料表面的小孔內(nèi),釘突及軟組織易從骨材料表面分離,B組長入骨組織內(nèi)的肉芽組織呈淡粉紅色模糊狀。X線攝片,C組骨材料與骨組織相鄰處有大量骨痂形成,缺損骨斷面因改建而變的圓鈍,并有新生毛細(xì)血管及肉芽組織長入,呈不透明狀,包裹骨材料的骨膜及軟組織無壞死和積液,B組少量骨痂,A組缺損明顯(見圖3)。

圖3 各組 4周 X線片顯示,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組移植區(qū)投射分界影像 (‘→′處)

植入后8周,B、C骨材料仍被較厚的軟組織包裹完全,無松動及移位現(xiàn)象,A組骨缺損有少量骨痂生成,無愈合。長入骨材料表面的結(jié)締組織釘突強(qiáng)度及韌性增加,可以從骨材料表面完整的撕脫,其中 C組的血管成分明顯減少,C組橈骨表面形態(tài)及質(zhì)地結(jié)構(gòu)與 A組十分接近。

植入后 12周,B、C組骨材料與相鄰組織結(jié)合緊密,包裹骨材料的組織質(zhì)地較韌、硬度增加,兩者間界線消失,無法完整分開。剖面可見兔橈骨植入?yún)^(qū)域內(nèi)的硬組織厚度增加,人工橈骨周邊形成一層質(zhì)地較軟組織硬的致密層。C組橈骨表面形態(tài)及質(zhì)地結(jié)構(gòu)與無損組織無明顯的差別,已恢復(fù)到正常的組織形態(tài)。X線片觀察,C組骨材料-骨界面之間的透射分界影像消失,而 A、B組投射分界影像還是明顯存在,植入?yún)^(qū)內(nèi) B、C骨材料的密度高于周邊正常骨組織(見圖4)。

圖4 各組 12周 X線片顯示,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組移植區(qū)投射分界影像(‘→′處)

2.2.2 組織學(xué)檢測 蘇木精-伊紅染色光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果:B、C組植骨區(qū)的新生骨面積隨著時(shí)間的推移逐漸增加,植骨區(qū)的材料剩余面積隨著時(shí)間的推移逐漸減少,且降解速度相對較快(見表1)。植入4周時(shí)鏡下觀察C組可見周邊明顯有成骨細(xì)胞分泌的新生骨基質(zhì)形成 (見圖5),而 B組則形成模糊新生軟骨基質(zhì)(見圖6)。植入8周時(shí)鏡下觀察C組植骨區(qū)有較多的成骨和血管長入材料中,成骨區(qū)內(nèi)可見到錐狀骨陷凹樣結(jié)構(gòu)和骨細(xì)胞,管狀結(jié)構(gòu)明顯增多。骨材料周圍大多被大量梭形細(xì)胞占據(jù),并有血管長入,新生的骨單位形狀不規(guī)則,周圍的骨質(zhì)尚未完全鈣化,接近皮質(zhì)骨的骨單位較成熟,骨膜下的則更幼稚(見圖7)。B組與 C組相似,但不如 C組成骨活躍。術(shù)后12周 C組骨材料基本降解,植入?yún)^(qū)內(nèi)基本被新生組織填滿,可見大量成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞 (見圖8)。

圖5 培養(yǎng) 4周 C組可見明顯骨基質(zhì)形成(蘇木精-伊紅染色,× 50)

圖6 培養(yǎng) 4周 B組可見模糊骨基質(zhì)形成(蘇木精-伊紅染色,×50)

分別在第 2、4、8、12周測量 B、C組新生骨面積和剩余骨面積,計(jì)算剩余骨面積和新生骨面積,使用 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件,通過多組數(shù)據(jù)方差分析,C組選擇顯著性T=0.05,前者 P=0.042,后者 P=0.001,都有顯著性差異,得出隨著時(shí)間的推移,新生骨正在逐步代替骨材料的結(jié)論,與 B組相似具體數(shù)據(jù)見表1。橫向?qū)Ρ葍山M的新生骨面積在2、4、8周時(shí)沒有顯著性差異 t＜0.05,在 12周時(shí)有顯著性差異 t＞ 0.05,橫向?qū)Ρ葍山M的骨材料剩余顆粒面積 2周時(shí)沒有顯著性差異 t＞ 0.05,在 4、8、 12周時(shí)有顯著性差異 t＜ 0.05。

圖7 培養(yǎng)8周 C組骨材料周圍見大量新骨形成,材料開始降解(蘇木精-伊紅染色,×50)

圖8 術(shù)后 12周 C組 HE切片,僅見極少量材料殘余(HE染色,× 50)

表1 牡蠣殼骨材料和MIIG骨材料植入?yún)^(qū)新生骨面積百分?jǐn)?shù)和骨材料剩余顆粒面積百分?jǐn)?shù)的數(shù)值

2.2.3 生物力學(xué)檢測 牡蠣殼復(fù)合型材料的抗彎曲強(qiáng)度為(46.43± 1.57)M Pa,MIIG組為 (41.20± 2.75)M Pa,自體骨為(47.07±2.40)MPa,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組與 MIIG組 (P＜0.05),MIIG組與自體骨組(P＜0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,牡蠣殼復(fù)合型骨材料組與自體骨組(P＞0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

牡蠣屬于軟體動物門的雙殼綱,全世界的牡蠣有 18屬100多種,我國大概有20種,全世界年產(chǎn)量在80萬噸以上。牡蠣殼資源廣泛,來源豐富,取材不破壞生態(tài)環(huán)境。牡蠣殼含有豐富的微量元素和大量氨基酸[7]。1997年,美國 FDA[8]已經(jīng)批準(zhǔn)將牡蠣作為原始材料加工成為牡蠣碳酸鈣補(bǔ)鈣劑。2002年牡蠣鈣獲得國家衛(wèi)生部批號。說明其具有較好的皮質(zhì)骨替代潛能。

實(shí)驗(yàn)通過大體掃描電鏡觀察,牡蠣殼復(fù)合型骨材料橫斷面可以觀測到5～20層致密的骨板樣結(jié)構(gòu),呈同心圓柱排列,板厚度在 200～300nm之間,板間由相互溝通的管道系統(tǒng)相聯(lián)系,最寬的管道達(dá) 600 nm,平均在 300 nm左右,這和人體骨的骨板、哈佛氏管與浮克曼管的數(shù)量、密度、形狀、孔徑、走向規(guī)律相類似。用排液法測得的骨材料孔隙率高達(dá) 40%～50%左右。當(dāng)孔隙超過30%以后,孔隙之間可達(dá)到互相連通,新骨組織可以從材料表面長入內(nèi)部,形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。骨材料抗壓強(qiáng)度為45～49M P。孔隙率控制在30%～50%,既能達(dá)到孔之間相通,又能滿足臨床初期對材料強(qiáng)度的要求,有效地發(fā)揮材料的支架作用[9-14]。這種多孔結(jié)構(gòu)形成的材料三維通道增大了材料與受植區(qū)組織器官的接觸界面,有利于加速界面結(jié)合的反應(yīng)過程,為新骨組織長入材料中提供通道和容納場所,并為攜帶骨誘導(dǎo)物質(zhì)(骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨髓)提供空間。該材料可根據(jù)需要通過預(yù)制或注塑的方式成形,具有良好的可操作性。植入后即可為缺損區(qū)的軟組織提供足夠的硬組織保護(hù)。

大體標(biāo)本表明,兔橈骨修復(fù)早期為肉芽組織長入材料表面的孔隙內(nèi),而后形成釘突樣結(jié)構(gòu),4周時(shí)牡蠣殼復(fù)合型骨材料外側(cè)可見粉紅色的肉芽軟組織釘突長入骨材料表面的小孔內(nèi),醫(yī)用硫酸鈣組有淡粉紅色較模糊肉芽組織長入骨組織內(nèi)。隨著植入時(shí)間的推移與材料結(jié)合更加緊密,最終材料與新生骨直接結(jié)合。X線攝片,本研究中修復(fù)材料的密度略低于正常兔橈骨,2周時(shí)X線攝片觀察到移植區(qū)內(nèi)密度影低于周邊;8周時(shí)牡蠣殼復(fù)合型骨材料與骨組織相鄰處有大量骨痂形成,缺損骨斷面因改建而變得圓鈍,醫(yī)用硫酸鈣組有少量骨痂,自體骨組缺損明顯。12周時(shí)牡蠣殼復(fù)合型骨材料組骨材料-骨界面之間的透射分界影像消失,而 A、B組投射分界影像還是明顯存在,高密度影像明顯高于周圍骨床,這表明牡蠣殼復(fù)合型骨材料可以更好地阻止結(jié)締組織的長入,起到三維支架的作用,在兔橈骨缺損區(qū)域內(nèi)引導(dǎo)形成新生骨,新生骨與材料影像疊加形成密度增高影像。

組織學(xué)檢測表明:牡蠣殼復(fù)合型骨材料的空隙之間相互聯(lián)通能為成骨細(xì)胞提供良好的攝取營養(yǎng)、生長和黏附空間。4周時(shí)有明顯骨基質(zhì)生成,而醫(yī)用硫酸鈣則只有模糊骨基質(zhì)生成,表明牡蠣殼骨誘導(dǎo)性相對較好,8周時(shí)牡蠣殼復(fù)合型骨材料組新骨形成和骨材料降解都較明顯,并可見大量血管,內(nèi)含豐富的紅細(xì)胞,醫(yī)用硫酸鈣組材料降解更加明顯,自體骨組未見成骨。術(shù)后12周時(shí),牡蠣殼復(fù)合型骨材料組基本降解,植入?yún)^(qū)內(nèi)基本被新生組織填滿,可見大量成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞,而醫(yī)用硫酸鈣組則完全降解,新生骨面積也相對牡蠣殼組小。這表明植入牡蠣殼復(fù)合型骨材料比醫(yī)用硫酸鈣組降解相對較慢,誘導(dǎo)骨生成相對較快,可以更持久的為大段骨缺損提供支架作用。生物力學(xué)測試顯示術(shù)后12周實(shí)驗(yàn)組與自體骨比較抗彎曲強(qiáng)度測試無明顯差別而優(yōu)于醫(yī)用硫酸鈣組,顯示了較好的材料成骨能力。

本實(shí)驗(yàn)組下一步將在牡蠣殼復(fù)合型骨材料中植入骨形態(tài)發(fā)生蛋白和成骨細(xì)胞,在體外實(shí)驗(yàn)探究牡蠣殼復(fù)合型骨材料是否對人體組織細(xì)胞生長、代謝、增殖產(chǎn)生影響,從無毒、無熱原、無刺激作用、不引起溶血反應(yīng)、無致癌性和致畸作用等方面證明牡蠣殼復(fù)合型骨材料的良好生物相容性。

本實(shí)驗(yàn)證明牡蠣殼復(fù)合型骨材料相對現(xiàn)今常用醫(yī)用硫酸鈣骨材料有著更好的生物學(xué)特性、骨誘導(dǎo)性、成骨能力,并能更持久的提供支架作用修復(fù)骨缺損。所以初步認(rèn)為天然牡蠣殼納米體復(fù)合型骨材料具備骨缺損修復(fù)材料所需的良好生物學(xué)特性。

[1] Gitelis S,Piaseaki P,Turner T,et al.Use of a calcium sul-fate based bone graft substitute for benign bone lesions[J].Orthopedics,2001,24(2):162-166.

[2] Bell W H.Resorption characteristics of bone and bolie substitutes[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol,1964(17):650-657.

[3] 劉 平,徐宏光,王弘,等.硫酸鈣生物骨水泥在填補(bǔ)骨缺損手術(shù)中的應(yīng)用 [J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,29(2):98-100.

[4] Currey JD,Zioupos P,Davies P,et al.Mechanical properties of nacre and highly mineralized bone[J].Proc Biol Sci,2001,268(1462):107-111.

[5] Mount AS,Wheeler AP,Paradkar RP,Snider D Hemocyte-mediated shell mineralization in the eastern oyster[J].Science,2004,304(5668):297-300.

[6] Simkiss K.The organic matrix of the oyster shell[J].Comp Biochem Physiol,1965,16(4):427-435.

[7] 陳玉枝,林舒.牡蠣殼與龍骨成分的分析[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,33(4):432-433.

[8] Yoon GL,Kim BT,Kim BO,et al.Chemical mechanical characteristics of crushed oyster-shell[J].Waste Manag,2003,23(9):825-834.

[9] Tsai CH,Lin RM,Ju CP,et al.Bioresorption behavior of tetracalcium phosphate-derived calcium phosphate cement implanted in femur of rabbits[J].Biomaterials,2008,29(8):984-993.

[10] Strauss EJ,Pahk B,Kummer FJ,et al.Calcium phosphate cement augmentation of the femoraI neck defect created after dynamic hip screw removal[J].Orthop Trauma,2007,21(5):295-300.

[11] Barralet JE,Gaunt T,Wright AJ,et al.Effect of porosity reduction by compaction on compressive strength and microstructure of calcium phosphate cement[J].Biomed Mater Res,2002,63(1):1-9.

[12] Korovessis P,Repantis Tf Petsinis G,et al.Direct reduction of thoracolum bar burst fractu Fes by means of balloon kyphoplasty with calcium phosphate and stabilization with pedicle-screw instrumentation and fusion[J].Spine,2008,33(4):100-108.

[13] Qi X,Ye J,Wang Y.Improved injectability and in vitro degradation of acalcium phosphate cement containing poly(1actide-c0-glycolidel microspheres[J].Acta Biomater,2008,4(6):1837-1845.

[14] Del Valle S,Mifio N,Mu Roz F,et al.In vivo evaluation of an injectable[J].Macroporous Calcium Phosphate Cemer,2007,6(9):208-209.