雄激素對(duì)雄性大鼠心臟衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的影響

王艷妮, 談世進(jìn)

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雄激素對(duì)雄性大鼠心臟衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的影響

王艷妮, 談世進(jìn)

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院老年病科, 上海 200233）

觀察補(bǔ)充外源性睪酮及給予雄激素受體阻斷劑后對(duì)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的影響, 探討雄激素與心臟衰老的關(guān)系。雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為去勢(shì)組（10只）、補(bǔ)充睪酮組（去勢(shì)+生理劑量睪酮組, 10只）、氟他胺組（去勢(shì)+生理劑量睪酮+氟他胺組, 10只）、假手術(shù)組（10只）。干預(yù)8周后測(cè)定各組血漿睪酮濃度, 取心肌組織用HE染色觀察心肌組織學(xué)變化; 組織化學(xué)染色觀察心肌組織細(xì)胞SA-β-Gal的活性。較假手術(shù)組睪酮濃度, 氟他胺組升高近3倍（＜0.01）; 與假手術(shù)組比較, 去勢(shì)組SA-β-Gal活性明顯增強(qiáng)[（2.0±0.9）（1.2±0.7）,＜0.01]; 與去勢(shì)組比較, 生理劑量補(bǔ)充睪酮組SA-β-Gal活性（0.9±0.8）明顯減弱（＜0.01）; 與單純補(bǔ)充生理劑量睪酮組比較, 氟他胺組SA-β-Gal活性（2.1±0.8）反而增強(qiáng)（＜0.01）; 補(bǔ)充生理劑量睪酮組與假手術(shù)組SA-β-Gal的活性相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.309）。雄激素缺乏可能影響雄性大鼠心肌組織中SA-β-Gal的活性, 提示心臟老化可能與雄激素水平相關(guān)。

雄激素; 雄激素拮抗藥; 心肌; 衰老; β-半乳糖苷酶

近年來(lái)大量研究表明, 隨著年齡的增長(zhǎng), 男性體內(nèi)雄激素水平逐漸下降是引起多種老年疾病和衰老的重要因素; 有研究證實(shí)外源性睪酮替代治療恢復(fù)睪酮水平至正?？筛纳圃S多性腺功能減退引發(fā)的癥狀[1],雄激素改善認(rèn)知能力、氧自由基及抗氧化系等方面衰老進(jìn)程已有報(bào)道[2,3]。早在1995年, 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)組織中β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色陽(yáng)性率隨年齡增加而增加, 他們把這種中性的β-半乳糖苷酶定義為衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（senescence- associated- β-galactosidase, SA-β-Gal）[4],目前SA-β-Gal作為一種體內(nèi)外細(xì)胞衰老的公認(rèn)標(biāo)志物已在老年醫(yī)學(xué)研究中廣泛采用。但是體內(nèi)SA-β-Gal活性在心肌組織細(xì)胞內(nèi)隨雄激素水平的變化如何變化, 與心臟衰老關(guān)系如何, 目前研究不多。本研究以大鼠去勢(shì)為模型, 研究補(bǔ)充生理劑量睪酮及雄激素受體阻斷劑干預(yù)后對(duì)心臟SA-β-Gal的影響, 以期揭示睪酮變化與心臟衰老的相關(guān)性, 為研究抗衰老的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠, 3～4月齡, 體質(zhì)量250 g左右, 共40只, 由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丙酸睪酮注射液由上海通用藥業(yè)股份有限公司提供, 批號(hào)100404, 氟他胺由上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司提供, 批號(hào)100702。

1.1.3主要試劑和儀器 SA-β-Gal染色試劑盒, T放射免疫試劑盒, 冰凍切片機(jī), Sn-695B型γ放射免疫計(jì)數(shù)器, 自動(dòng)平衡式離心機(jī), 光學(xué)顯微鏡等。

1.2 動(dòng)物模型和組織標(biāo)本的制備

1.2.1 大鼠去勢(shì)模型的建立和分組 將40只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組: 去勢(shì)組、補(bǔ)充睪酮組（去勢(shì)后補(bǔ)充睪酮組）、氟他胺組（去勢(shì)后補(bǔ)充睪酮+雄激素受體阻斷劑組）、假手術(shù)組, 每組10只。全部適用性喂養(yǎng)2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。在腹腔注射氯胺酮（2 mg/kg）麻醉后, 需要去勢(shì)的3組大鼠碘酒、酒精消毒陰囊皮膚, 縱膈正中切開(kāi)一縱行切口, 剪開(kāi)鞘膜后, 分別將雙側(cè)睪丸與附睪分離并且切除睪丸, 然后把附睪放回陰囊, 青霉素沖洗腹腔后逐層縫合皮膚, 術(shù)后腹腔注射青霉素, 2×104U/d, 共3 d; 假手術(shù)組只找出雙側(cè)睪丸與附睪分離但不切除, 然后放回陰囊。

1.2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與給藥 常規(guī)條件下分籠飼養(yǎng), 光線保持12 h晝夜循環(huán), 室溫控制在27℃左右, 濕度維持在40%～50%, 自由進(jìn)水、進(jìn)食, 標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。去勢(shì)組, 大鼠去勢(shì)后皮下注射等量芝麻油正常飼養(yǎng)至8周; 補(bǔ)充睪酮組, 大鼠去勢(shì)后注射生理劑量睪酮, 2mg/(kg·2d), 8周[5]。氟他胺組, 大鼠去勢(shì)后注射生理劑量睪酮[2mg/（kg·2d）]+氟他胺[1mg/（kg·d）][6]灌胃, 8周, 丙酸睪酮注射液用無(wú)菌芝麻油稀釋后皮下注射。除氟他胺組外其余各組均給予等量生理鹽水灌胃為對(duì)照。

1.2.3 取材 給藥8周后取材。麻醉大鼠后, 剖開(kāi)胸腔, 暴露心臟并取血, 分別注入預(yù)先制備好的EDTA抗凝管及普通管, 管口封閉好并顛倒混勻即放入4℃冰箱中1～2 h, 取出后25004℃離心7 min,分離出血漿或血清, 取上清分裝, －80℃冰箱凍存?zhèn)溆? 取出心臟用冰生理鹽水沖洗后剪取左心室, 然后分兩半, 一半心肌組織做新鮮組織冰凍切片作組織化學(xué)染色; 另一半心肌組織入多聚甲醛液中固定24 h后石蠟包埋作HE染色。

1.3 觀察內(nèi)容和檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血漿睪酮水平的放射免疫測(cè)定 將待測(cè)血漿樣本冷水復(fù)融, 采用碘標(biāo)記的放射免疫測(cè)定法, 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.2 各組大鼠心肌組織HE染色病理形態(tài)學(xué)變化 石蠟切片做HE染色, 嚴(yán)格按照HE染色的操作步驟進(jìn)行, 最后在光學(xué)顯微鏡下觀察, 并在高倍顯微鏡下拍照。

1.3.3 心肌組織衰SA-β-Gal活性檢測(cè) 組織化學(xué)染色法, 在pH 6.0的條件下染色16 h檢測(cè)SA-β-Gal活性; pH 7.4的條件下, 所有組織SA-β- Gal活性均為陰性（作為對(duì)照）。具體步驟按試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行, 光學(xué)顯微鏡下觀察, 陽(yáng)性細(xì)胞染成靛藍(lán)色或紫藍(lán)色。采用半定量計(jì)分法進(jìn)行結(jié)果分析[7]: 0分, 無(wú)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn); 1分, 偶見(jiàn)陽(yáng)性染色信號(hào); 2分, 局灶性陽(yáng)性染色信號(hào)出現(xiàn); 3分, 彌漫性陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。光學(xué)顯微鏡下每例大鼠隨機(jī)選2張切片, 每張切片選取細(xì)胞分布均勻的5個(gè)高倍視野作為觀察區(qū), 計(jì)算平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血漿睪酮濃度的變化

與假手術(shù)組睪酮濃度相比[（2.47±0.53mg/L）], 去勢(shì)組明顯降低[（0.28±0.07）mg/L,＜0.01], 補(bǔ)充睪酮組無(wú)明顯差異[（2.92±0.94）mg/L,＞0.01], 而氟他胺組升高近3倍[（6.13±0.42）mg/L,＜0.01]。

2.2 心肌組織形態(tài)學(xué)變化

與假手術(shù)組比較, 去勢(shì)組有明顯的心肌組織細(xì)胞病理?yè)p傷改變, 而補(bǔ)充生理劑量睪酮組心肌組織病理?yè)p傷不明顯, 氟他胺組與去勢(shì)組有類似的組織病理變化（圖1）。

圖1 心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變

Figure 1 Pathological changes of myocardial tissue(HE ×200)

A: 去勢(shì)組, 心肌細(xì)胞肥大且伴有空泡變性, 細(xì)胞核形態(tài)退變, 小區(qū)肌纖維有溶解與斷裂; B: 補(bǔ)充睪酮組, 細(xì)胞形態(tài)基本正常, 未見(jiàn)明顯纖維溶解; C: 氟他胺組, 心肌細(xì)胞空泡樣變性明顯, 細(xì)胞核形態(tài)欠規(guī)則, 且心肌細(xì)胞的排列極性消失; D: 假手術(shù)組, 細(xì)胞形態(tài)正常, 心肌纖維化程度不明顯

2.3 心肌組織衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性變化

與假手術(shù)組比較, 去勢(shì)組SA-β-Gal活性明顯增強(qiáng)[（2.0±0.9）（1.2±0.7）,＜0.01]; 與去勢(shì)組比較, 生理劑量補(bǔ)充睪酮組SA-β-Gal活性[（0.9±0.8）（2.0±0.9）]明顯減弱（＜0.01）; 與單純補(bǔ)充生理劑量睪酮組比較, 氟他胺組SA-β-Gal活性[（2.1±0.8）（0.9±0.8）]反而增強(qiáng)（＜0.01）; 補(bǔ)充生理劑量睪酮組與假手術(shù)組SA-β-Gal活性相比[（0.9±0.8）（1.2±0.7）], 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.309, 圖2）。

3 討 論

1995年, Dimri等[4]研究結(jié)果提示SA-b-Gal是體內(nèi)外細(xì)胞衰老研究的標(biāo)志。目前老年醫(yī)學(xué)研究中廣泛采用SA-β-Gal作為一種公認(rèn)標(biāo)志物。劉新強(qiáng)等[8]以H2O2為刺激因子刺激乳鼠心肌成纖維細(xì)胞, 促使乳鼠發(fā)生衰老, 并用生理濃度睪酮干預(yù)其衰老, 結(jié)果表明H2O2刺激后72h,SA-β-Gal染色陽(yáng)性率升高, 細(xì)胞增殖能力減弱, 細(xì)胞發(fā)生衰老; 當(dāng)給予乳鼠生理濃度的睪酮干預(yù)后, 可增加細(xì)胞增殖率, 抑制SA-β-Gal陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá), 減輕細(xì)胞的衰老, 而雄激素受體阻斷劑氟他胺則可部分阻斷上述生理濃度睪酮的保護(hù)作用。本研究以去勢(shì)雄性大鼠為動(dòng)物模型, 給予外源性干預(yù)后觀察心肌組織中SA-β-Gal活性的變化。結(jié)果表明, 去勢(shì)后未補(bǔ)充丙酸睪酮的大鼠血漿睪酮濃度明顯低于假手術(shù)組, 心肌組織中SA-β-Gal活性顯著增強(qiáng), 與此同時(shí)HE染色發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化較假手術(shù)組明顯, 出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大伴空泡樣變性, 部分心肌纖維發(fā)生溶解與斷裂, 但心肌纖維化程度不明顯; 而給予生理濃度睪酮補(bǔ)充后, 心肌組織中SA-β-Gal活性與假手術(shù)組無(wú)明顯差異, 同時(shí)形態(tài)學(xué)變化差異也不明顯。研究中心肌組織的病理改變與SA-b-Gal活性雖然不能一一對(duì)應(yīng), 但是衰老細(xì)胞不管處于哪一期都不再發(fā)揮生理功能, 這樣的細(xì)胞不斷增多后勢(shì)必出現(xiàn)組織形態(tài)上的改變。這一結(jié)果與劉新強(qiáng)等人的研究結(jié)果相一致。

圖2心肌組織SA-β-Gal檢測(cè)

Figure 2 Myocardial SA-β-Gal staining (×200)

A: 去勢(shì)組; B: 補(bǔ)充睪酮組; C: 氟他胺組; D: 假手術(shù)組

本實(shí)驗(yàn)結(jié)論證實(shí)氟他胺可部分阻斷上述生理濃度睪酮的保護(hù)作用, 這也提示衰老的心肌組織可能從生理濃度的睪酮治療中獲益, 產(chǎn)生此效應(yīng)的途徑與組織內(nèi)存在的雄激素受體（androgen receptor, AR）相關(guān)。既往研究結(jié)果表明, 正常雄性大鼠心肌組織中AR分布很廣泛。本研究提示雄激素對(duì)心肌衰老的干預(yù)作用是通過(guò)AR途徑, 但是其機(jī)制尚未闡明, 對(duì)于衰老的兩大類理論機(jī)制具體有何種影響還需更深入的研究來(lái)證實(shí)。本研究存在的問(wèn)題是干預(yù)時(shí)間短, 對(duì)于延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間后有何變化是否還和現(xiàn)在的結(jié)果一致并未觀察, 另外去勢(shì)后給予干預(yù)時(shí)間起點(diǎn)還存在爭(zhēng)議。

衰老細(xì)胞和處于死亡相M2期的細(xì)胞都可以表達(dá)β-Gal（pH=6）, X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）染色不能區(qū)分這兩類[9], 不能認(rèn)為染色陽(yáng)性就是衰老細(xì)胞, 但是這兩種狀態(tài)下的細(xì)胞都不再分裂增殖, 故可以認(rèn)為染色陽(yáng)性的細(xì)胞已處于增殖死亡狀態(tài), 喪失其應(yīng)有的生理功能, 進(jìn)而組織器官出現(xiàn)功能障礙。近年來(lái)大量研究結(jié)果顯示, β-Gal的表達(dá)在老化細(xì)胞中顯著增強(qiáng), 且這種增強(qiáng)與細(xì)胞衰老表型的出現(xiàn)和細(xì)胞增殖能力的喪失相平行, 可間接反應(yīng)細(xì)胞的老化程度。筆者的研究發(fā)現(xiàn), 維持生理濃度睪酮的大鼠心肌組織病理形態(tài)無(wú)明顯改變, 但低于生理濃度睪酮的大鼠心肌組織細(xì)胞肥大且伴有空泡變性, 細(xì)胞核形態(tài)退變, 小區(qū)肌纖維有溶解與斷裂; 給予氟他胺后血漿睪酮濃度顯著高于生理濃度, 形成較高濃度的睪酮結(jié)果對(duì)心肌組織損害加重。這就涉及到雄激素治療的安全性問(wèn)題, 故在應(yīng)用雄激素治療某些疾病時(shí)要充分權(quán)衡其利弊。但是, 筆者實(shí)驗(yàn)中并未觀察到心肌纖維化程度的明顯變化, 各組之間的差異很小, 出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能與干預(yù)措施的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān), 這也就提示我們?nèi)梭w激素紊亂對(duì)機(jī)體功能的影響是個(gè)慢性的過(guò)程, 關(guān)于是否對(duì)老年男性早期給予雄激素補(bǔ)充或在機(jī)體功能障礙時(shí)給予補(bǔ)充治療, 還需要全面權(quán)衡其利弊。

總之, 雄激素水平的變化可影響心肌組織中SA-β-Gal活性, 其效應(yīng)可能是通過(guò)AR的途徑發(fā)揮的, 提示心臟老化與雄激素密切相關(guān), 但其機(jī)制尚不清楚, 有待進(jìn)一步的探索。

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（編輯: 周宇紅）

Androgen and expression of senescence-associated-β-galactosidase in heart of male rats

WANG Yanni, TAN Shijin

(Department of Geriatrics, Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China)

To observe the effects of exogenous testosterone replacement and androgen receptor block agent administration on the expression of senescence-associated-β-galactosidase(SA-β-Gal), and to determine the relationship between androgen and myocardial senescence.Forty male Wistar rats were randomly divided into castrated group, testosterone group (castrated＋physiological dose of testosterone), flutamide group (castrated＋physiological dose of testosterone+flutamide) and sham group, with 10 in each group. After 8 weeks, blood testosterone concentration was measured; myocardium tissues were examined for histomorphology by HE staining; activity of SA-β-Gal was determined immunohistochemically.Compared with sham operation group, testosterone concentration was almost three times higher than that in flutamide group (＜0.01). The activity of SA-β-Gal was obviously enhanced in castrated group than in sham group[(2.00±0.86)(1.15±0.67),＜0.01]. Compared with castrated group, the activity of SA-β-Gal was significantly weakened in testosterone group[(0.90±0.79),＜0.01]. Compared with testosterone group, the activity of SA-β-Gal was enhanced in flutamide group[(2.05±0.76),＜0.01]. There was no statistical difference in the activity of SA-β-Gal between testosterone group and sham group（=0.309）.Androgen deficiency may influence the activity of SA-β-Gal in the heart of male rats. It suggests that myocardial senescence is possibly associated with androgen levels.

androgen; antagonists, androgen; myocardium;senescence; β-galactosidase

“()(YG2010MS35)”.

R361+2

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00014

2011-05-18;

2011-09-29

上海交通大學(xué)“醫(yī)工(理)交叉基金(YG2010MS35)”

談世進(jìn), Tel: 021-64369181, E-mail: sjxt@yahoo.com.cn