基質(zhì)金屬蛋白酶9在大鼠單純收縮期高血壓模型發(fā)生中的作用

雷夢覺, 朱光照, 陳慰云, 艾文偉 , 鄔 甦, 吳克琴

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基質(zhì)金屬蛋白酶9在大鼠單純收縮期高血壓模型發(fā)生中的作用

雷夢覺1*, 朱光照2, 陳慰云3, 艾文偉1, 鄔 甦1, 吳克琴1

（1江西省人民醫(yī)院干部心內(nèi)二科 江西省心血管病研究所 江西省老年醫(yī)學(xué)研究所, 南昌 330006;2江西省新余市人民醫(yī)院心內(nèi)科, 新余 330046;3南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部, 南昌 330008）

研究基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在單純收縮期高血壓形成中的作用。選用8周齡Wistar雄性大鼠20只作為研究對象, 隨機分成兩組, 模型組（=10）和對照組（=10）。應(yīng)用華法林和維生素K1誘導(dǎo)動脈中層鈣化, 8周后右側(cè)頸動脈插管進行有創(chuàng)血壓和心室內(nèi)壓力的檢測。以及取材主動脈, Von Kossa 染色分析動脈鈣化程度; 采用原子吸收光譜法測定血管組織中鈣含量。采用彈性纖維染色法觀察主動脈組織中彈性纖維形狀; 應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot 檢測主動脈組織中MMP-9的表達水平。模型組大鼠血壓與對照組相比明顯增高[收縮壓: （151±9）（113±7）mmHg,＜0.01, 舒張壓: （122±10）（98±8）mmHg,＜0.05]; 而各組間平均左室內(nèi)壓無明顯變化。模型組大鼠血壓變化的同時伴有動脈形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變, 主動脈和頸動脈中層鈣化明顯, 模型組主動脈鈣含量明顯高于對照組[(17.9±1.8)(5.8±0.6)mg/g,＜0.01]。彈力纖維斷裂變直, 失去波浪形狀。Western免疫印跡法分析模型組MMP-9蛋白表達較對照組明顯升高。利用華法林和維生素K1誘導(dǎo)的單純收縮期高血壓大鼠是可重復(fù)性好, 便捷, 以及與人體衰老相似較為理想的模型。MMP-9酶表達明顯增多可促使大動脈中層彈力蛋白降解和鈣在彈力纖維薄層的沉積, 從而在單純收縮期高血壓形成中發(fā)揮著一定作用。

大鼠; 單純收縮期高血壓; 動脈鈣化; 基質(zhì)金屬蛋白酶9

單純收縮期高血壓（isolated systolic hypertension,ISH）是老年人高血壓的主要類型, 具有很高心腦血管病并發(fā)癥風(fēng)險, 隨著年齡的增加發(fā)病率日趨增高[1]。2003年美國預(yù)防、檢測、評估與治療高血壓全國聯(lián)合委員會第七次報告（JNC7）明確提出“50歲以上成年人, 收縮壓＞140mmHg是比舒張壓更為重要的心血管病危險因素”。

ISH動脈壁結(jié)構(gòu)的異常包括動脈鈣化, 彈力纖維斷裂、減少, 以及膠原的增多、沉積[2]。鈣化在動脈壁可沉積于不同的層面, 所形成的機制也不完全相同, 內(nèi)膜鈣化發(fā)生在動脈粥樣硬化斑塊病變區(qū), 中層鈣化出現(xiàn)在彈性纖維薄層[2]。Blumenthal就曾記載在582例尸檢主動脈標本中, 20～30歲年齡組只有4%的患者有明顯鈣化, 而50歲以后中層鈣化比例高達98%[2]。Elliott等也從58例尸檢胸主動脈標本發(fā)現(xiàn)鈣含量的變化在人平均生命周期中增長約30～40倍, 并主要集中在動脈彈力纖維中層[3]。臨床上很早就發(fā)現(xiàn)動脈中層鈣化（medial elastocalcinosis, MEC）隨著年齡增長而越來越明顯, 在一些疾病過程中如高血壓、糖尿病和終末期腎疾病, MEC形成更為突出[4]。Gillessen等[5]應(yīng)用血管內(nèi)超聲發(fā)現(xiàn)ISH患者年齡和動脈鈣化程度呈正相關(guān)。Guerin等[6]也通過動脈超聲學(xué)檢查和高分辨攝片綜合評分, 發(fā)現(xiàn)血管鈣化程度與收縮壓及脈壓增高密切相關(guān)。London等[7]進一步發(fā)現(xiàn)在高分辨攝片下內(nèi)膜鈣化呈現(xiàn)不規(guī)則斑片狀分布, 中層鈣化呈現(xiàn)出均一的雙軌樣線性分布; 其收縮壓和脈搏波傳導(dǎo)速度與無鈣化患者相比均明顯增高, 而舒張壓相對較低。因此, 鈣在彈力纖維薄層的沉積最終結(jié)果是促進ISH形成, 動脈中層鈣化可能是引起ISH的主要原因之一, 但由于缺乏合適的ISH動脈中層鈣化動物模型, 基礎(chǔ)研究相對薄弱。

2003年Essalihi等[8]應(yīng)用華法林和維生素K（WVK）慢性施藥模擬出一個ISH動物模型。WVK模型主要的病理過程緣于大動脈彈力纖維薄層鈣化、斷裂和膠原增多, 代表了老年人ISH的一些特征。在Essalihi的研究中探討了血管中層鈣化與單純收縮壓變化的關(guān)系, 但對于ISH大鼠動脈鈣化為什么會局限在血管中層卻沒有進一步的闡明。在腹主動脈損傷的大鼠中, 損傷處鈣化明顯并伴明膠酶大量生成[9]。因此本課題研究: 我們擬在成功建立WVK模型的基礎(chǔ)上, 研究明膠酶在MEC可能的形成機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗采用健康Wistar雄性大鼠20只, 體質(zhì)量175～200 g或年齡6～7周, 均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。華法林鈉購自芬蘭奧立安藥廠, 維生素K購自蕪湖制藥公司。鈣鹽染色試劑盒和彈力纖維染色試劑盒購自福建邁新公司, 彈力纖維EVG染色試劑盒購自廣東貝索公司, 總蛋白提取試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司, 免疫組織化學(xué)染色試劑盒以及免疫印跡染色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2 分組

動物購回適應(yīng)性喂養(yǎng)1周, 飼以隨意鼠類顆粒飲食, 隨后隨機分成兩組, 對照組（=10）和WVK制模組（=10）, 每3天記錄體質(zhì)量, 并分別于8周后進行有創(chuàng)血液動力學(xué)測定、組織形態(tài)學(xué)檢測和生化分析。WVK制模組給予華法林[15 mg/（kg·d）]于自由飲水中, 維生素K1[15 mg/（kg·d）]背部皮下注射。維生素K1比華法林提前1周用藥, 華法林的用藥量根據(jù)飲水量于第2天相對調(diào)節(jié)。其余大鼠則同時給予等量溫開水灌胃, 一直到實驗結(jié)束。

1.3 有創(chuàng)血壓及心功能的檢測

大鼠統(tǒng)一深度麻醉后右側(cè)頸動脈插管, 接通多道生理記錄系統(tǒng), 穩(wěn)定5 min測定實驗動物的動脈和心室內(nèi)波形及壓力值, 記錄收縮壓、舒張壓、脈壓、心率和心室內(nèi)壓力。分析頸動脈血壓和心室內(nèi)壓力關(guān)系, 以明確頸動脈血壓變化的同時心功能有無變化。

1.4 原子吸收法測定動脈組織中鈣的含量

將主動脈組織（約10 mg）于80℃徹底烤干, 加入2 mol/L濃硝酸消化并烤干后, 用去離子水（含27 nmol/L氯化鉀溶液和27μmol/L氯化鑭溶液）復(fù)融, 取1.5 ml樣品, 加入1%氯化鍶溶液150 μl。用原子吸收分光光度計在422.7nm波長下測定各管的吸光度值, 從標準曲線上查出鈣含量, 并換算成μmol/g干重組織。

1.5 Van kossa染色檢測血管鈣沉積

1.5.1 固定 4%甲醛溶液固定或其他固定液均可。

1.5.2 試劑配制 2%硝酸銀水溶液即硝酸銀2g, 蒸餾水100ml。

1.5.3 操作步驟 （1）石蠟切片按常規(guī)脫臘、水洗, 蒸餾水洗滌3次。（2）浸入2%硝酸銀水溶液, 置于強日光下或紫外線光下處理10～60 min。（3）蒸餾水洗滌3次, 大約3～5 min。（4）5%硫代硫酸鈉水溶液2 min。（5）蒸餾水洗滌。（6）0.5%伊紅或麗春紅-苦味酸-維多利亞藍染色法對比染色。（7）無水乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封固。結(jié)果: 鈣鹽染色呈黑色, 其他組織染色呈對比染色的顏色。

1.6 彈力纖維染色法和彈力纖維EVG染色法

1.6.1 彈力纖維染色法試劑配制 試劑: 高錳酸鉀（試劑A）; 草酸（試劑B）; 醛品紅染液（試劑C）; 橙黃G染液（試劑D）。操作步驟: （1）甲醛溶液固定石蠟切片常規(guī)脫臘止水; （2）滴加1滴高錳酸鉀（試劑A）孵育5min, 稍水洗; （3）滴加1滴草酸（試劑B）處理15s; （4）流水稍沖, 甩干, 70%乙醇稍洗, 甩干; （5）滴加1滴醛品紅染液（試劑C）染色10min, 70%乙醇浸洗2次（每次30s, 至切片不再脫色為止）稍水洗;（6）滴加1滴橙黃G染液（試劑D）染色1s, 稍水洗; （7）95%乙醇、無水乙醇, 透明、封固。結(jié)果: 彈力纖維呈深紫色, 底色為不同程度的黃色。

1.6.2 彈力纖維EVG染色法試劑配制 試劑: 0.25%高錳酸鉀溶液; 0.5%草酸溶液; Elastin Stain Van Gieson。操作步驟: （1）組織切片常規(guī)脫臘止水; （2）高錳酸鉀氧化5 min,蒸餾水洗; （3）草酸漂白5 min, 蒸餾水洗; （4）95%乙醇稍洗, 入彈力纖維染色液（Elastin Stain）中8～24 h; （5）95%乙醇或1%鹽酸風(fēng)化（必要時鏡下觀察）; （6）充分自來水洗, 蒸餾水洗; （7）用VG液對比染色1 min, 95%乙醇急速分化數(shù)秒, 無水乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封固。結(jié)果: 彈力纖維呈藍黑色, 膠原纖維呈紅色, 肌纖維、紅細胞呈黃色。

1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測MMP-9

1.7.1 試劑配制 試劑: 3%H2O2去離子水; 試劑A: 封閉用正常兔血清工作液; 試劑B: 生物素標記兔抗山羊IgG二抗工作液; 試劑C: 辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液。

1.7.2 操作步驟 （1）石蠟切片常規(guī)脫臘止水。（2）3%H2O2去離子水孵育5～10 min, 以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。（3）抗原熱修復(fù)。（4）蒸餾水沖洗, PBS浸泡5 min。（5）滴加試劑A室溫孵育10～15 min, 傾去, 勿洗。（6）滴加適當1︰100稀釋的一抗, 37℃孵育2～3 h。（7）PBS沖洗, 3 min×3次。（8）滴加試劑B, 室溫孵育10～15 min。（9）PBS沖洗, 3 min×3次。（10）滴加試劑C, 室溫孵育10～15 min。（11）PBS沖洗, 3 min×3次。（12）DAB顯色。（13）自來水充分沖洗。（14）復(fù)染, 無水乙醇脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封固。

1.8 Western免疫印跡法測定MMP-9

1.8.1 試劑準備 30%儲備膠溶液100 ml, 1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.0） 100 ml, 1mol/L Tris-HCl（pH6.8）100 ml, 10%SDS 100 ml, 10×電泳緩沖液100 ml, 10%過硫酸銨（AP）10 ml, 2×SDS電泳上樣緩沖液, 考馬斯亮蘭225 ml, 脫色液, 勻漿緩沖液, 轉(zhuǎn)膜緩沖液 1000 ml, 0.01 mol/L PBS（pH7.4）1000 ml, 膜染色液 118 ml, 包被液。顯色液, 10%分離膠, 10%積層膠。

1.8.2 操作步驟 （1）將大鼠動脈組織與勻漿緩沖液低溫條件下1︰5混合后手動勻漿, 提取動脈組織總蛋白后檢測蛋白濃度并定量。（2）樣品處理: 將40 μg樣品加入等量的2×SDS上樣緩沖液, 100℃加熱3～5 min, 離心12 000×, 1 min, 取上清作SDS- PAGE分析, 同時將預(yù)染Marker作平行處理。（3）上樣: 取10 μl樣品加入樣品池中, 并加入20 μl低分子量蛋白標準品作對照。（4）電泳: 在電泳槽中加入1×電泳緩沖液, 連接電源, 負極在上, 正極在下, 電泳時, 膠電壓180V, 電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止。（5）電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小, 用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡, 5 min×3次。（6）膜處理: 預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和醋酸纖維膜, 浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min。（7）轉(zhuǎn)膜: 轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、醋酸纖維膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好, 濾紙、凝膠、醋酸纖維膜精確對齊, 每一步去除氣泡, 上壓500 g重物, 將碳板上多余的液體吸干。接通電源, 恒壓100V, 轉(zhuǎn)移90 min。轉(zhuǎn)移結(jié)束后, 斷開電源將膜取出, 割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色, 放入膜染色液中50 s后, 在50%甲醇中多次脫色, 至背景清晰, 然后用雙蒸水洗, 風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存, 留與顯色結(jié)果作對比。（8）用0.01 mol/LPBS洗膜, 5 min×3次。（9）加入包被液, 平穩(wěn)搖動, 室溫2 h。（10）棄包被液, 用0.01 mol/L PBS洗膜, 5 min×3次。（11）加入一抗, 4℃放置12 h以上。（12）棄一抗和1%BSA, 用0.01 mol/L PBS分別洗膜, 5 min×4次。（13）加入辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗, 平衡搖動, 室溫2 h。（14）棄二抗, 用0.01 mol/L PBS洗膜, 5 min×4次。（15）加入顯色液, 避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。（16）光密度掃描進行表達的定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組間血流動力學(xué)變化

WVK模型組給予華法林于自由飲水中和維生素K1皮下注射后無明顯出血傾向和不良反應(yīng), 體質(zhì)量增長與空白對照組相似, 無動物死亡。多道生理記錄系統(tǒng)能準確地記錄和分析實驗動物的血壓變化, 各組實驗大鼠均成功進行頸總動脈插管并取得較好的實驗效果。

表1結(jié)果表明, 華法林和維生素K1用藥8周后收縮壓水平明顯高于對照組（＜0.01）; 舒張壓水平也高于對照組; 平均動脈壓和脈壓水平均高于對照組（＜0.01）; 心率與對照組比較, 差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）; 平均左室內(nèi)壓與對照組相比無明顯變化。

表1 兩組間血流動力學(xué)參數(shù)和相關(guān)比較

注: 1mmHg=0.133kPa。HR: 心率; SBP: 收縮壓; DBP: 舒張壓; LVP: 左室內(nèi)壓; PP: 脈壓; MAP: 平均動脈壓; BM: 體質(zhì)量; HM: 心臟質(zhì)量。與對照組比較,*＜0.05,**＜0.01

2.2 兩組主動脈與臟器鈣含量的變化

如表2所示, 華法林和維生素K1用藥8周后能誘導(dǎo)主動脈鈣含量增加。火焰原子吸收法測定動脈組織鈣含量WVK模型組明顯高于對照組（＜0.05）;心臟左心室和腎臟的鈣含量與空白對照組相比沒有發(fā)生明顯的變化（＞0.05）。圖1所示動脈中層鈣化與脈壓變化呈正相關(guān)（=0.71,＜0.01;2=0.51）。Von Kossa 染色顯示主動脈鈣化嚴重, 鈣化呈現(xiàn)波浪狀或斑片狀, 主要局限分布于彈力纖維中層, 并與外膜相連（圖2）。

2.3 兩組間動脈結(jié)構(gòu)的改變

ISH大鼠心臟質(zhì)量與對照組相比沒有發(fā)生明顯的增加, 同時也沒有增加心臟質(zhì)量/體質(zhì)量（表1）。彈力纖維EVG染色法顯示, 華法林和維生素K1用藥8周后血管壁彈力纖維和膠原面積并沒有明顯改變, 但膠原/彈力纖維明顯增大（C/E）, 從圖3可看出, WVK模型組大鼠在動脈中層鈣化部位彈力纖維層變直變薄或斷裂, 波浪狀外觀消失, 減少的部分被膠原補充。因此, 隨著鈣沉積在彈力纖維之間, 逐漸融和于鄰近組織, 彈力纖維減少, 膠原沉積增多,動脈結(jié)構(gòu)被破壞。

表2 兩組間主動脈與臟器鈣含量的比較

注: 與對照組比較,**＜0.01

圖1 脈壓與主動脈鈣含量直線相關(guān)分析

Figure 1 Linear regression between aortic calcium contentand pulse pressure(PP) (2=0.51)

圖2 兩組大鼠主動脈Von Kossa染色結(jié)果

Figure 2 Light microscopy of aortic sections (Von Kossa′40)

A: 模型組, 頸動脈和主動脈鈣化嚴重, 鈣化呈現(xiàn)波浪狀或斑片狀, 主要局限分布于彈力纖維中層; B: 對照組, 動脈不發(fā)生鈣化

2.4 兩組間MMP-9活性水平改變

免疫組化顯示華法林和維生素K1用藥8周后MMP-9生成增多, 在胞核部位及少量胞質(zhì)可見散在棕黃色分布, 對照組未見棕黃色顆粒（圖4）。Western blot結(jié)果顯示兩個條帶（圖5）, 分別為92ku（pro-MMP-9）和82ku（MMP-9活酶）。pro-MMP-9 為MMP-9酶原, 不具有酶活性。對照組MMP-9表達很弱, MMP-9活酶低水平表達; WVK模型組MMP-9表達較對照組明顯增多, 酶原和活酶從量上看基本相當（圖5B）。

圖3 兩組主動脈彈力纖維染色結(jié)果

Figure 3 Elastin and collagen in aorta (EVG′40)

A: 模型組; B: 對照組

圖4 兩組主動脈免疫組化檢測MMP-9結(jié)果

Figure 4 A matrix metalloproteinase MMP-9 in aorta evaluated by immunohischemistry (DAB′40)

A: 模型組; B: 對照組

Figure 5 MMP-9 in aorta determined by Western blot

A: 電泳結(jié)果; B: 定量分析結(jié)果. 與對照組比較,**＜0.01

3 討 論

本實驗大鼠經(jīng)過華法林和維生素K18周的干預(yù), 其血流動力學(xué)監(jiān)測表現(xiàn): 收縮壓與舒張壓升高和脈壓差增大, 心率加快, 與文獻報道有差異[8], Essalihi等[8]研究中舒張壓和心率與對照組無顯著性差異, 而本研究舒張壓升高的原因可能系心率加快的結(jié)果。從病理結(jié)果看鈣化主要局限在大動脈中層即分布于彈力纖維中層, 同時彈力纖維斷裂減少, 膠原沉積增多, 動脈的結(jié)構(gòu)被破壞, 與Essalihi等[8]研究中結(jié)果相似。結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了動脈硬化, 脈壓差增大。實驗數(shù)據(jù)表明: 動脈鈣化水平與脈壓成正相關(guān), 動脈鈣含量與脈壓變化的相關(guān)分析提示, 50%動脈鈣含量變化可解釋脈壓的變化, 而平均左室內(nèi)壓并無明顯變化, 說明血壓變化來自血管本身而不是心臟功能的改變。

因此, 從ISH大鼠模型的實驗中我們發(fā)現(xiàn)鈣在動脈的沉積是血壓和脈壓增高的重要原因, 其中也包括C/E比值變化的影響。在健康人體大動脈彈力纖維中層存在基質(zhì)Gla蛋白（matrix Gla protein, MGP）, 當大動脈彈力纖維中層發(fā)生鈣化時, 其MGP明顯減少, 但鈣化與正常組織交界區(qū)可見大量MGP分解的肽, 表明MGP成熟障礙是人體大動脈中層鈣化重要原因[8]。MGP是能夠抑制異位鈣化的鈣調(diào)蛋白, 敲除MGP基因大鼠動脈中層出現(xiàn)廣泛鈣化并于出生后不久大動脈破裂導(dǎo)致死亡[10]。MGP在最初合成時并不具有生物學(xué)活性, 只有羧化后才能充分發(fā)揮其作用。MGP活化過程需要維生素K協(xié)助。華法林屬香豆類抗凝藥, 能夠干擾維生素K循環(huán), 引起Gla生成障礙, 從而阻止了MGP功能的正常發(fā)揮。WVK模型主要的病理過程緣于大動脈彈力纖維薄層鈣化、斷裂和膠原增多, 代表了老年人ISH的一些特征, 并與敲除MGP鼠具有基本一致的病變特點, 說明了MGP在抑制動脈鈣化中的重要作用[11]。在臨床發(fā)現(xiàn)透析患者MGP減少可引起動脈鈣化[10]。但由于WVK模型出現(xiàn)時間短, 在國內(nèi)還未有系統(tǒng)報道。

MGP成熟障礙為什么引起彈力纖維降解和鈣化? 對于MGP抗鈣化的詳細機制仍不很清楚, 一些研究認為可能與其含有的5個Gla基團有關(guān), Gla能夠結(jié)合鈣并抑制鈣質(zhì)沉積和羥基磷灰石晶體的增長[12]?？杉せ畛晒切曰虮磉_, 如堿性磷酸酶和骨橋蛋白（osteopontin, OPN）等表達增多[13,14]。Bendeck等[15]研究證明: 在動脈平滑肌細胞中OPN與αvβ3整合素受體結(jié)合可刺激血管平滑肌細胞大量產(chǎn)生MMPs。國外文獻報道[9]: 明膠酶參與了彈力蛋白和基質(zhì)降解, 降解的彈力蛋白肽易于鈣化。MMPs可能在動脈中層鈣化形成過程中起非常重要的作用。MMPs是一種內(nèi)源性鋅-依賴性酶家族, 目前已發(fā)現(xiàn)有20余種之多, 根據(jù)MMPs作用底物的不同, 可分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解酶和膜型基質(zhì)蛋白酶, 幾乎能夠降解血管基質(zhì)的所有成分。華法林和維生素K1用藥8周后MMP-9酶原和活酶都明顯增多, 動脈中層鈣化嚴重。等[16]和Yang等[17]在用CaCl2滲透血管外膜造成腹主動脈中膜鈣化的動物模型中, MMP-9和MMP-2基因缺失鼠卻并不會產(chǎn)生彈力纖維的降級和鈣化, 這提示明膠酶在動脈中層鈣化中有顯著作用。MMP-9和MMP-2現(xiàn)在已被普遍認為能夠和彈力蛋白相結(jié)合, 這也是彈力蛋白降解的第一步。降解的彈力蛋白肽易于鈣化, 并且血管平滑肌細胞鈣化后也能與降解的彈力蛋白肽緊密結(jié)合促成彈力纖維薄層鈣化[18]。因此彈力蛋白長久以來被認為是鈣化的成核位點[9]。等[9]發(fā)現(xiàn), 在MEC形成的初始階段, 主要表現(xiàn)為彈力纖維附近的微小鈣沉著的形成, 彈力纖維薄層的自然波狀外觀并不改變。隨后鈣沉積在彈力纖維之間, 逐漸融和于鄰近組織, 彈力纖維斷裂變薄, 波狀外觀消失, 膠原沉積并且結(jié)構(gòu)破壞。在本實驗ISH大鼠模型中主要表現(xiàn)大動脈中層彈力纖維斷裂、破壞, 鈣鹽沉積, 膠原增生和MMP-9酶活性及表達增加。而MMP-9在大動脈組織升高則可能發(fā)揮著一定的作用。

[1] Franklin SS, Khan SA, Wong ND,. Is pulse pressure useful in predicting risk for coronary heart disease[J]? Circulation, 1999, 100(4): 354-360.

[2] Dao HH, Essalihi R, Bouvet C,. Evolution and modulation of age-related medial elastocalcinosis: impact on large artery stiffness and isolated systolic hypertension[J]. Cardiovas Res, 2005, 66(2): 307-317.

[3] Elliott RJ, McGrath LT. Calcification of the human thoracic aorta during aging[J]. Calcif Tissue Int, 1994, 54(4): 268- 273.

[4] Davies MR, Hruska KA. Pathophysiological mechanisms of vascular calcification in end-stage renal disease[J]. Kidney Int, 2001, 60(2): 472-479.

[5] Gillessen T, Gillessen F, Sieberth H,. Age-related changes in the elastic properties of the aortic tree in normotensive properties of the aortic tree in normotensive patients: investigation by intravascular ultrasound[J]. Eur J Med Res, 1995, 1(3): 144-148.

[6] Guerin AP, London GM, Marchais SJ,. Arterial stiffening and vascular calcifications in end-stage renal disease[J]. Nephrol Dial Transphlant, 2000, 15(7): 1014- 1021.

[7] London GM, Guerin AP, Marchais SJ,.Arterial media calcification in end-stage renal disease: impact on all-cause and cardiovascular mortality[J]. Nephrol Dial Transplant, 2003, 18(9): 1731-1740.

[8] Essalihi R, Dao HH, Yamaguchi N,. A new model of isolated systolic hypertension induced by chronic warfarin and vitamin K1 treatment[J]. Am J Hypertens, 2003, 16(2): 103-110.

[9] Basalyga DM, Simionescu DT, Xiong W,.Elastin degradationand calcification in an abdominal aorta injury model: role of matrix metalloproteinases[J]. Circulation, 2004, 110(22): 3480-3487.

[10] Luo G, Ducy P, McKee MD,. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein[J]. Nature, 1997, 386(6620): 78-81.

[11] 朱光照, 雷夢覺. 單純收縮期高血壓大動脈中層鈣化形成機制[J]. 中華高血壓雜志, 2008, 16(4): 300-302.

[12] Price PA, Faus SA, Williamson MK. Warfarin causes rapid calcification of the elastic lamellae in rat arteries and heart valves[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1998, 18(9): 1400-1407.

[13] Vattikuti R, Towler DA. Osteogenic regulation of vascular calcification: an early perspective[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004, 286(5): E686-E696.

[14] Hruska KA, Mathew S, Saab G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification[J]. Circ Res, 2005, 97(2): 105-114.

[15] Bendeck MP, Irvin C, Reidy M,. Smooth muscle cell matrix metalloproteinase production is stimulatedαvβ3integrin[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20(6): 1467-1472.

[16] Niederhoffer N, Bobryshev YV, Lartaud-Idjouadiene I,. Aortic calcification produced by vitamin D3 plus nicotine[J]. J Vasc Res, 1997, 34(5): 386-398.

[17] Yang H, Curinga G, Giachelli CM. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix minera-lization[J]. Kidney Int, 2004, 66(6): 2293-2299.

[18] Bailey M, Xiao H, Ogle M,. Aluminum chloride pretreatment of elastin inhibits elastolysis by matrix metallo-proteinases and leads to inhibition of elastin-oriented calci-fication[J]. Am J Pathol, 2001, 159(6): 1981-1986.

（編輯: 周宇紅）

Matrix metalloproteinase-9 in rat model of isolated systolic hypertension

LEI Mengjue1*, ZHU Guangzhao2, CHEN Weiyun3, AI Wenwei1, WU Su1, WU Keqin1

(1Department of Geriatirc Cardiology, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006, China;2Department of Cardiology, Jiangxi Provinvial Xinyu Municipal People￠s Hospital, Xinyu 330046, China;3Department of Basic Medicine, Medical College, Nanchang University, Nanchang 330008, China)

To investigate the role ofmatrix metalloproteinase-9(MMP-9) in the formation of isolated systolic hypertension so as to provide a new model of isolated systolic hypertension.Twenty 8-week old male Wistar rats were randomly divided into the model group (=10)and control group(=10). To induce large artery calcification, rats were treated with warfarin and vitamin K1. Eight weeks later, blood pressure and left ventricular pressure were measured by right carotid arterial cannulation. The segments from each aorta were processed for histological analysis by Von Kossa methed. Aortic calcium contents were calculated in each group with atom-spectrum. Elastic fiber structure in aorta was analyzed by elastic fiber staining. MMP-9 expression was determined by immunohistochemistry and Western blot.Compared with control group, blood pressures were significantly higher in model group[systolic blood pressure: (151±9)(113±7)mmHg,＜0.01; diastolic blood pressure: (122±10)(98±8)mmHg,＜0.05]. The mean left ventricular pressure was not significantly different between the two groups. In model group, the blood pressure fluctuation was associated with morphological change of the aorta, such as extensive arterial medial elastocalcinosis. Compared with control group, calcium content in aorta was significantly higher in model group[(17.9±1.8)(5.8±0.6)mg/g,＜0.01]; the elastic lamellae was flatten and lost natural waviness. Western blot analysis showed that MMP-9 protein expression level was significantly higher in model groupthan in control group.Chronic treatment with warfarin and vitamin K1produce a satisfactory model of isolated systolic hypertension which is identical to the disorder in humans. The elevated expression of MMP-9 enhances the elastin degeneration and calcification of the aortic elastic fibers and plays a role in the formation of isolated systolic hypertension.

rats; vascular calcification; matrix metalloproteinase 9

(20074002)

R541.3

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00015

2011-04-20;

2011-10-12

江西省衛(wèi)生廳重大攻關(guān)課題(20074002)

雷夢覺, Tel: 0791-86896319, E-mail: leimengjue@medmail.com.cn