乳源酪蛋白糖巨肽改善炎癥性腸病的研究進(jìn)展

朱晨晨，陳慶森*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

乳源酪蛋白糖巨肽改善炎癥性腸病的研究進(jìn)展

朱晨晨，陳慶森*

(天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

乳源酪蛋白糖巨肽(CGMP)主要是κ-酪蛋白經(jīng)凝乳酶降解產(chǎn)生的一類含有糖鏈的多肽，具有許多的生理活性功能和獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性，可廣泛地應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥品。本文首先概括CGMP的來(lái)源、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其研究開發(fā)現(xiàn)狀，從炎癥性腸病(IBD)的免疫病理機(jī)制的角度，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)外在CGMP調(diào)理、改善和治療IBD的相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)地介紹，提出CGMP在一定程度上為IBD的生物免疫治療提供了新的途徑以及展示其廣闊的開發(fā)前景。

酪蛋白糖巨肽(CGMP)；炎癥性腸病(IBD)；免疫調(diào)節(jié)；腸道菌群

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn,s disease，CD)，是一組病因未明的慢性腸道炎癥性疾病，具有遺傳易感性。目前大多學(xué)者認(rèn)為腸壁黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、持續(xù)的腸道感染、腸壁黏膜屏障缺損、致病菌和有益菌之間的平衡失調(diào)，遺傳和環(huán)境等因素共同參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程[1-2]。臨床上對(duì)IBD患者的藥物治療包括5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、抗生素和免疫抑制劑，但療效并不令人滿意，且毒副作用較大，復(fù)發(fā)率較高，因此開發(fā)一種有效的營(yíng)養(yǎng)治療方案成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)是一種來(lái)源于牛乳κ-酪蛋白的生物活性肽，不含芳香族氨基酸，可作為苯丙酮酸尿癥(PKU)患者的營(yíng)養(yǎng)食品。此外，CGMP諸多的生物活性已得到證實(shí)，如抗微生物毒素[3]、促益生菌增殖[4-5]以及免疫調(diào)節(jié)[6-7]等活性，目前已有許多學(xué)者陸續(xù)地對(duì)CGMP的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行探索性的研究，但國(guó)內(nèi)關(guān)于其改善和治療IBD的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文首先概括CGMP的來(lái)源、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其研究開發(fā)現(xiàn)狀，從炎癥性腸病的免疫病理機(jī)制的角度，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)外學(xué)者最新的研究成果，對(duì)酪蛋白糖巨肽調(diào)理、改善和治療IBD的相關(guān)研究進(jìn)行系統(tǒng)地介紹，提出CGMP在一定程度上為IBD的生物免疫治療提供了新的途徑以及展示其廣闊的開發(fā)前景。

1 CGMP的來(lái)源、結(jié)構(gòu)性質(zhì)及其研究開發(fā)現(xiàn)狀

1.1 來(lái)源

酪蛋白糖巨肽(CGMP)于1953年開始被研究，Alais等[8]在研究凝乳酶對(duì)牛奶酪蛋白溶液的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理后的牛乳以及酪蛋白鹽溶液，在12%三氯乙酸溶液的可溶性氮含量明顯增加。1956年，Waugh等[9]發(fā)現(xiàn)了酪蛋白。1965年，Delfour等[10]發(fā)現(xiàn)，利用凝乳酶切斷κ-酪蛋白的105苯丙氨酸106甲硫氨酸部位，產(chǎn)生不溶的副κ-酪蛋白和TCA可溶的多肽兩部分。通常此可溶性的多肽有30%～50%是以糖基化的形式存在，因此被稱為“糖巨肽”，而酪蛋白來(lái)源的此類肽則統(tǒng)稱為酪蛋白糖巨肽(CGMP)。

1.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

κ-酪蛋白來(lái)源的CGMP的氨基酸序列現(xiàn)已研究清楚[11]，它是從κ-酪蛋白的N末端106位甲硫氨酸(Met)開始至169位C末端纈氨酸(Val)結(jié)束的64個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的，其序列有A/B型兩種，即：106H·Met-Ala-Ile-Pro-Pro110-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys-Thr-Glu-Ile-Pro120-Thr-Ile-Asn-Thr-Ile-Ala-Ser-Gly-Glu-Pro130-Thr-Ser-Thr-Pro-Thr-Thr/Ile-Glu-Ala-Val-Glu140-Ser-Thr-Val-Ala-Thr-Leu-Glu-Asp/Ala-Ser-Pro150-Glu-Val-Ile-Glu-Ser-Pro-Pro-Glu-Ile-Asn160-Thr-Val-Gln-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Val169·OH。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是富含支鏈氨基酸，幾乎不含有芳香族氨基酸如苯丙氨酸(Phe)，只含有一個(gè)甲硫氨酸(Met)，沒(méi)有二級(jí)結(jié)構(gòu)，其在波長(zhǎng)280nm處無(wú)吸收峰，很難用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)，只在205～217nm處有吸收峰，因此，經(jīng)常用210nm/280nm處的紫外(UV)吸收差來(lái)評(píng)價(jià)CGMP的純度。

牛的CGMP主要有A型和B型兩種[12]，它們的不同在于此多肽鏈的136位和148位的氨基酸不同，即A型的136位和148位氨基酸分別為蘇氨酸(Thr)和天冬氨酸(Asp)，而B型的為異亮氨酸(Ile)和丙氨酸(Ala)。CGMP中的131、133、135、136位和142位的蘇氨酸殘基為糖配體化的部位，127位和149位的絲氨酸(Ser)為磷酸化的部位[13-15]，都是實(shí)現(xiàn)其生理功能的重要位點(diǎn)。

在酪蛋白糖聚肽中，糖基基團(tuán)主要有3種：Gal-半乳糖、N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuNAc，也稱唾液酸)、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，糖鏈主要是以O(shè)-糖苷型結(jié)合的2種中性和3種酸性糖鏈，90%以上的結(jié)合糖鏈都含唾液酸。已經(jīng)被證實(shí)存在5種糖[16]：?jiǎn)翁牵篏alNAc-O-R(0.8%)；二糖：Galβ1→ 3GalNAc-O-R(6.3%)；三糖：NeuAcα2→ 3Galβ5→ 3GalNAc-O-R(18.4%)；三糖：Galβ1→ 3(NeuAα2→ 6)GalNAc-O-R(18.5%)；四糖：NeuAcα2→3Galβ1→3(NeuAcα2→6)GalNAc-O-R(56%)。

1.3 研究開發(fā)現(xiàn)狀

目前，生產(chǎn)CGMP的方法主要有以下兩種：一是從甜乳清中分離純化CGMP，二是用酶水解牛乳酪蛋白生產(chǎn)CGMP，其中以第一種方法較多。其分離方法主要涉及沉淀法、超濾法、色譜分離法以及綜合分離純化的方法。早期制備CGMP的方法主要是在酸性介質(zhì)中分離熱處理變性后的乳清蛋白，再用乙醇選擇性沉淀。1988年，Morr等[17]利用三氯乙酸(TCA)沉淀法只能分離出含有糖配體的CGMP，并且CGMP的回收率只占乳清粉的6.7%[18]。Tolkach等[19]于2004年建立用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TGase)交聯(lián)和膜分離技術(shù)相結(jié)合的方法分離乳清蛋白中的各種活性成分，得到了較好的效果。本實(shí)驗(yàn)室李博智等[20]利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase)結(jié)合微濾技術(shù)從乳清中分離純化CGMP。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出最佳酶反應(yīng)條件為乳清粉質(zhì)量濃度8g/100mL，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶添加量7U/g、pH6.5、溫度39℃、反應(yīng)時(shí)間80min，最后經(jīng)微濾可得到純度為70%左右的CGMP。其分離方法步驟簡(jiǎn)單、分離周期短、成本較低，易于擴(kuò)大生產(chǎn)。但是由于所得的CGMP為交聯(lián)體，其生物學(xué)功能尚不明確，然而作為苯丙酮酸尿癥(phenylketonuria，PKU)病人的專用蛋白補(bǔ)劑將具有很好的開發(fā)前景。此外，本實(shí)驗(yàn)室始終以努力提高原料乳的附加值和綜合利用水平為宗旨，利用不同技術(shù)手段成功地從乳中分離純化出CGMP，并建立起了相應(yīng)的成熟工藝路線[20-21]，為實(shí)現(xiàn)CGMP以及相關(guān)生物活性產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。到目前為止，工業(yè)化生產(chǎn)CGMP主要考慮的因素包括生產(chǎn)價(jià)格、產(chǎn)品純度以及操作周期。日本一家公司同時(shí)采用先進(jìn)的過(guò)濾技術(shù)以及離子交換技術(shù)，最早實(shí)現(xiàn)了CGMP的工業(yè)化，為CGMP廣泛的應(yīng)用提供了可能。美國(guó)的威斯康星也產(chǎn)業(yè)化C G M P。國(guó)內(nèi)尚無(wú)此產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)?？傊?，對(duì)CGMP的制備以及實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)還需深入地探討和研究。

2 IBD發(fā)病機(jī)理

2.1 免疫因素

2.1.1 免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞

原始T細(xì)胞可分化為各種T細(xì)胞亞群，包括輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)、抑制性T細(xì)胞(Ts細(xì)胞)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)等。1986年，Mosmann等[22]首先將Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩大類。Th1細(xì)胞以表達(dá)IL-12、IFN-γ、TNF-α為主，介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞以表達(dá)IL-4、IL-5、IL-10為主，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。Th1和Th2細(xì)胞之間相互作用調(diào)節(jié)著機(jī)體免疫平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，研究報(bào)道顯示Th1/Th2亞群失衡可能是IBD的重要發(fā)病機(jī)制之一[23-24]。

Treg細(xì)胞是一類不同于Th1和Th2的T細(xì)胞亞群，依賴特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3以維持穩(wěn)定表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞－細(xì)胞間直接接觸和釋放IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子而抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活化，維持自身免疫耐受[25]。根據(jù)表面標(biāo)志物、分泌的細(xì)胞因子及作用機(jī)制的不同，可分為不同的亞型，目前對(duì)這類細(xì)胞研究較多的一類亞型是CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞，可從人的胸腺和外周血中分離到。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，如果CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞數(shù)量減少、功能異常或抑制功能受損，均可導(dǎo)致腸黏膜損傷，從而誘發(fā)IBD，然而，給予Treg細(xì)胞可治愈實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道炎癥[26]。因此Treg細(xì)胞在IBD的發(fā)病和治療中起著重要作用。

Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的CD4＋T細(xì)胞亞群，其主要分泌IL-17。近年對(duì)IBD遺傳背景的研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17及影響Th17細(xì)胞分化的IL-23受體基因多態(tài)性與IBD的發(fā)病相關(guān)[27-28]，提示Th17細(xì)胞參與了IBD的發(fā)病過(guò)程。研究也表明T細(xì)胞各亞群之間是相互制約，且在一定條件下可相互轉(zhuǎn)化。IBD的免疫紊亂可能是多細(xì)胞亞群之間的失衡造成的。

2.1.2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子主要由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生，在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IL-17、IL-23、TNF-α、IFN等屬于促炎細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)?？寡准?xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，參與體液免疫反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)被視為IBD的重要發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞因子失調(diào)可由Thl/Th2紊亂引起，并反饋性地加重Thl/Th2失衡，從而形成惡性循環(huán)。近期的研究還顯示，炎癥是生物體應(yīng)對(duì)病原體和有害刺激時(shí)的復(fù)雜生物反應(yīng)。半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)通過(guò)切割I(lǐng)L-1β、IL-18和IL-33的前體，參與了炎癥反應(yīng)；Caspase-1的激活是自身嚴(yán)格調(diào)控的，并成為限制炎癥的又一個(gè)獨(dú)特機(jī)理，也就是說(shuō)Caspase-1炎性體在自體炎癥疾病中發(fā)揮重要的作用[29]。

2.1.3 腸黏膜屏障

腸上皮細(xì)胞有Toll樣受體(TLR)、NOD1、NOD2受體以及特異性抗體的受體表達(dá)，上皮細(xì)胞特異性NF-κB激活或抑制成為IB D免疫應(yīng)答激活或抑制的節(jié)點(diǎn)。NF-κB信號(hào)通路既能維持腸上皮正常黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，又可介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答，對(duì)黏膜屏障兼具保護(hù)和損害作用。散布于絨毛隱窩中的Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等均能對(duì)抗微生物，并且有助于上皮細(xì)胞和腸黏膜的修復(fù)，減輕結(jié)腸炎癥損傷程度。提示腸上皮屏障損傷可能參與了IBD的發(fā)病過(guò)程。

2.2 微生物因素

腸道內(nèi)存在著大量的微生物，這些共生菌群與人體健康息息相關(guān)。Mazmanian等[30]研究證明腸道菌群失調(diào)是造成免疫失衡，誘發(fā)IBD等腸道疾病的主要原因。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，特發(fā)性慢性結(jié)腸炎可能完全是由腸道菌群失調(diào)所致，大多數(shù)動(dòng)物在無(wú)菌環(huán)境中不發(fā)生結(jié)腸炎，但在腸道菌群內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)迅速發(fā)生結(jié)腸炎[31]。正常腸道共生菌群及其產(chǎn)物可能作為自身抗原而誘導(dǎo)免疫耐受，腸道感染時(shí)，一些條件致病菌損害腸黏膜屏障，腸腔內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)物等抗原移位至腸黏膜固有層并激活黏膜免疫系統(tǒng)，使之對(duì)腸腔內(nèi)抗原失去耐受，從而誘發(fā)IBD。臨床觀察顯示微生物所致的腸道感染能使緩解期IBD復(fù)發(fā)[32]。

3 乳源CGMP對(duì)IBD的改善作用

近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室在連續(xù)獲得兩項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金的資助下，系統(tǒng)地從CGMP對(duì)腸道免疫調(diào)控系統(tǒng)、腸道菌群變化以及和腸道炎癥反應(yīng)的相關(guān)性等方面進(jìn)行了研究。

3.1 乳源CGMP對(duì)IBD的免疫調(diào)節(jié)作用研究

賈玉臣等[33]以UC動(dòng)物模型為對(duì)象，初步研究了CGMP對(duì)惡唑酮(oxazolone，OXZ)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的治療效果，從CGMP對(duì)模型小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸炎的3項(xiàng)氧化損傷指標(biāo)(二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、髓過(guò)氧化物酶(my e lo p ero x id a s e，M PO)及丙二醛(malondialdehyde，MDA))、大體形態(tài)損傷評(píng)分以及病理組織形態(tài)的影響這四個(gè)方面進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型對(duì)照組的氧化損傷指標(biāo)DAO活力、MPO活力以及MDA含量均比正常小鼠組顯著升高，由此可知潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織具有明顯的氧化損傷；通過(guò)灌胃不同劑量的CGMP，結(jié)果顯示低劑量的CGMP使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的MPO活力顯著降低，中劑量的CGMP使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量顯著降低，高劑量CGMP使?jié)冃越Y(jié)腸炎小鼠DAO活力和MPO活力顯著降低，因此，CGMP可能通過(guò)發(fā)揮抗炎活性抑制腸道炎癥反應(yīng)，從而使?jié)冃越Y(jié)腸炎的病征得到緩解。此外研究結(jié)果還證實(shí)了CGMP能夠保持較完整的上皮細(xì)胞，維持結(jié)腸組織形態(tài)的完整。灌胃低、中、高劑量的CGMP一段時(shí)間后，可有效改善OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，其中以中劑量CGMP的作用較為顯著。因此CGMP可作為一種營(yíng)養(yǎng)方案使小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎在一定程度上得到治療。

Daddaoua等[34]以IBD動(dòng)物模型為對(duì)象，研究了CGMP對(duì)三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎的治療效果，從CGMP對(duì)模型大鼠的體質(zhì)量、大體形態(tài)損傷評(píng)分以及與炎癥相關(guān)的因子(如AP、iNOS、IL-1β、TFF3等)在結(jié)腸炎中的表達(dá)水平等方面研究CGMP在腸道中的抗炎作用，并且進(jìn)一步比較了CGMP與治療IBD的藥物柳氮磺胺吡啶的抗炎效果。研究證實(shí)灌胃合適劑量的CGMP可以有效地降低結(jié)腸炎大鼠的形態(tài)損傷、AP的活性和iNOS等炎癥因子的表達(dá)，其抗炎效果與柳氮磺胺吡啶相同。Requena等[35]也以IBD動(dòng)物模型為對(duì)象，研究了CGMP對(duì)TNBS誘導(dǎo)大鼠回腸炎的治療效果，研究證實(shí)灌胃合適劑量的CGMP可顯著降低回腸炎大鼠的形態(tài)損傷、MPO活力、iNOS和COX-2的表達(dá)，其抗炎效果與治療IBD的藥物5-對(duì)氨基水楊酸相同。該研究還發(fā)現(xiàn)Th17和Treg細(xì)胞在CGMP的抗炎作用中起著重要作用，與TNBS模型對(duì)照組相比，灌胃合適劑量的CGMP可顯著降低回腸炎大鼠Treg細(xì)胞的表面標(biāo)記Foxp3的表達(dá)和Th17表達(dá)的IL-17 mRNA水平，由此可知CGMP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能以及下調(diào)IL-17發(fā)揮抗炎作用來(lái)改善和緩解回腸炎的病癥。

目前IBD的發(fā)病機(jī)制已從細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、腸道菌群等方面得以闡釋，炎癥細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子之間的平衡將成為治療IBD的重要靶點(diǎn)。賈玉臣等[36]研究了CGMP對(duì)健康小鼠IFN-γ和IL-4的調(diào)節(jié)作用，探討CGMP可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡從而發(fā)揮在腸道內(nèi)的抗炎作用，使IBD的病癥得以緩解。研究顯示灌胃小鼠CGMP 12h內(nèi)IL-4會(huì)出現(xiàn)明顯的增高趨勢(shì)，而在實(shí)驗(yàn)期間IFN-γ并未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)；在連續(xù)5d灌胃CGMP的實(shí)驗(yàn)期間，CGMP組小鼠在灌胃后第2天至第5天腸黏膜的IL-4質(zhì)量濃度明顯高于對(duì)照組和空白對(duì)照組，而IFN-γ在實(shí)驗(yàn)期間也未表現(xiàn)出明顯的變化趨勢(shì)，從而使得在連續(xù)灌胃后的第2天至第5天CGMP組的IFN-γ/IL-4比值較空白對(duì)照組與生理鹽水組均低，提示CGMP可能具有下調(diào)Th1/Th2的潛在功效，但是CGMP對(duì)IFN-γ的影響是不顯著的，該結(jié)論與Requena等[37]近期的研究成果是一致的。CGMP可促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-4表達(dá)的結(jié)論為進(jìn)一步研究CGMP在腸道內(nèi)的抗炎機(jī)制提供了佐證，同時(shí)也表明調(diào)控Th1和Th2平衡對(duì)解決相關(guān)炎癥性疾病具有重要作用。Requena等[38]還研究發(fā)現(xiàn)了CGMP可以通過(guò)激活NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。眾多資料顯示UC和CD患者腸黏膜組織活檢中NF-κB p65亞單位表達(dá)明顯上調(diào)，在IBD復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)中，NF-κB活化可能是一中心環(huán)節(jié)，因此CGMP介導(dǎo)NF-κB和MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活是其發(fā)揮抗炎作用、調(diào)理和治療IBD可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室最近也完成了乳源CGMP改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎機(jī)制的研究，以灌胃CGMP劑量為50mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃5d為基礎(chǔ)，利用流式微珠陣列技術(shù)(cytometric bead array，CBA)和酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)檢測(cè)各組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α和IL-10的濃度，并利用Western Bloting技術(shù)檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織蛋白中MAPK p38和NF-κB p65表達(dá)的差異，從細(xì)胞因子和免疫信號(hào)通路的角度探討CGMP發(fā)揮抗炎活性的機(jī)制。研究證實(shí)CGMP通過(guò)抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)NF-κB和MAPK的激活，有效抑制UC小鼠體內(nèi)IL-1β、IL-5、IFN-γ和TNF-α的升高，同時(shí)促進(jìn)IL-10的分泌，從而減緩炎癥程度。

3.2 乳源CGMP維持腸道微生物菌群作用的研究

大量研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)和內(nèi)環(huán)境的改變和腸道持續(xù)感染會(huì)引起IBD的發(fā)生和復(fù)發(fā)。曹晉宜等[5]研究了CGMP對(duì)小鼠腸道菌群消長(zhǎng)規(guī)律的影響，研究證實(shí)CGMP不同灌胃劑量對(duì)小鼠腸道微生物區(qū)系中各菌群的影響存在顯著的促進(jìn)和調(diào)控優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)的特性，對(duì)構(gòu)建膜菌群具有顯著的作用。其中中劑量組(80μg/d和100μ/d)可以有效促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌增殖，同時(shí)能夠有效降低腸桿菌、腸球菌，特別是致病菌的繁殖，有效降低了腸道中致病菌和條件致病菌的數(shù)量，可以調(diào)整機(jī)體的微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。由此可知灌胃適當(dāng)劑量的CGMP后腸道中益生菌得到顯著的增殖，條件致病菌和致病菌的增殖得到有效抑制，這就可以有效地防止細(xì)菌易位現(xiàn)象的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸道占位性保護(hù)作用。提示我們CGMP可能通過(guò)維持腸道微生態(tài)的平衡，糾正菌群失調(diào)，從而具有可以改善和調(diào)理IBD的作用。2010年曹晉宜等[39]報(bào)道了基于ERICPCR技術(shù)研究CGMP對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，其目的是了解CGMP對(duì)小鼠腸道中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化的影響。研究結(jié)果證實(shí)了小鼠腸道內(nèi)的微生物群落非常豐富，普遍存在共有的優(yōu)勢(shì)菌群，且優(yōu)勢(shì)菌群的群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定；CGMP能夠顯著增加小鼠腸道菌群的多樣性；聚類分析結(jié)果顯示：對(duì)照組小鼠個(gè)體在不同時(shí)間的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，對(duì)照組小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)范圍為1.75±0.06，CGMP組多樣性指數(shù)范圍為1.89±0.04，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明采用ERIC-PCR技術(shù)分析鑒定在灌胃小鼠CGMP期間其ERIC-PCR指紋圖譜沒(méi)有明顯的規(guī)律；CGMP組小鼠個(gè)體的ERIC-PCR指紋圖譜被明顯地分成兩個(gè)亞族，說(shuō)明小鼠灌胃CGMP 3～5d后，其腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)開始發(fā)生明顯變化。

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，IBD的發(fā)病機(jī)理以及開發(fā)一種有效的治療方案一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)外的最新研究可以證實(shí)CGMP具有抗炎活性，在一定程度上可以改善、緩解和治愈IBD。同時(shí)，CGMP是一種乳源的生物活性肽，具有廣泛的生物學(xué)功能，決定了其潛在的商業(yè)價(jià)值和開發(fā)的可行性。因此CGMP可以作為功能性食品用于炎癥性腸病的生物免疫治療，為解決IBD等常見(jiàn)、難愈疾病提供了一條新的、有效的途徑。但CGMP的科學(xué)明確的抗炎活性機(jī)制還有待于后續(xù)從分子水平上研究解決，圍繞其對(duì)一些免疫分子和免疫信號(hào)途徑的影響將有助于進(jìn)一步闡明治療IBD的機(jī)制。

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Research Progress in Bovine Casein Glycomacropeptide for the Improvement of Inflammatory Bowel Disease

ZHU Chen-chen，CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Casein glycomacropeptide (CGMP) is mainly a class of peptides bearing carbohydrate chains derived from the hydrolysis ofκ-casein by tenet. Because CGMP has many physiological functions and unique nutritional properties, it can be widely used in the fields of functional food and medicine. CGMP has been reported to have anti-inflammatory activity such as improvement and immunotherapy on inflammatory bowel disease (IBD). In this paper, the sources, structural characteristics and current research status of CGMP are outlined. Recent research advances in the regulatory, improving and therapeutic effects of CGMP on IBD are reviewed. Moreover, the future development prospects of CGMP are also proposed.

casein glycomacropeptide (CGMP)；inflammatory bowel disease (IBD)；immunoregulation; intestinal flora

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0262-05

2011-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071522)

朱晨晨(1988—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚噪呐c健康。E-mail：zcckathy@126.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵生物技術(shù)、蛋白資源開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：chenqs1689@163.com