肝癌組織血管內(nèi)皮生長因子與受體的表達(dá)及其臨床意義

周 輝，牟洪超，孫 茂，董立軍

在肝癌的治療中，手術(shù)切除被認(rèn)為是首選的方法，雖然術(shù)后配合介入治療、微波治療、射頻消融、生物免疫療法等，但肝癌的病死率仍然很高，術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響患者術(shù)后長期生存的首要原因。大量研究表明腫瘤血管生成是惡性腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)[1]，而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 是血管形成的關(guān)鍵因子，VEGF通過與血管內(nèi)皮生長因子受 體 （vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結(jié)合后使受體磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路而實現(xiàn)促血管形成效用。肝癌組織中癌細(xì)胞依靠豐富的新生血管網(wǎng)快速生長，并通過血管網(wǎng)在肝內(nèi)發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。近年許多研究已發(fā)現(xiàn)VEGF在肝癌組織中廣泛表達(dá)，促進(jìn)血管形成，促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2]。本文通過免疫組化檢測肝癌手術(shù)切除標(biāo)本VEGF及VEGFR，分析它們與肝癌的臨床病理特征及術(shù)后生存率的聯(lián)系，以了解它們對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響及評估預(yù)后，為預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及提高術(shù)后生存率提供更多方法。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本組76例為在筆者所在醫(yī)院肝膽外科2004-03～2007-12住院的手術(shù)患者，均為首次手術(shù)，術(shù)后病理證實為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，術(shù)前未行放、化療或介入治療，術(shù)后均依據(jù)不同病情行1~2次介入治療，術(shù)后至少隨訪2年以上，開始2年內(nèi)1~3個月隨訪1次，以后6~12個月隨訪1次，最長已隨訪5年，生存時間從手術(shù)之日起開始計算。男59例，女17例；年齡34~61歲，平均48.7歲。有乙肝病史者69例，丙肝病史者3例，無肝炎者4例；合并不同程度肝硬化64例，無明顯肝硬化12例；術(shù)前肝功能均為Child-A級；術(shù)前AFP>400 ng/L 59例，AFP≤400 ng/L 17例；增強(qiáng)CT掃描檢查發(fā)現(xiàn)腫塊位于肝右葉43例，左葉27例，左內(nèi)與右前葉交界部位4例，尾狀葉2例；腫塊單發(fā)69例，有2~3個病灶者7例 (6例為局限于1葉或1段內(nèi)，1例為右后葉及左外葉各1個病灶)；有門靜脈轉(zhuǎn)移者9例，形成膽管癌栓者3例，術(shù)后病理證實伴肝段或肝葉內(nèi)微小灶轉(zhuǎn)移灶者12例，所有76例術(shù)前檢查均排除遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移；腫塊直徑>5 cm者61例，≤5 cm者15例；腫瘤界限清楚存在假包膜者41例，界限不清無明顯包膜或包膜不完整35例；術(shù)后病理檢查高分化19例、中分化36例、低分化21例。

1.2 免疫組化染色 VEGF、VEGFR測定：選取肝癌手術(shù)標(biāo)本中無壞死的部分以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。組織蠟塊切片、脫蠟，免疫組化法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），嚴(yán)格按試劑盒操作流程說明進(jìn)行操作。鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人VEGFR單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品，采用免疫組化SP法做VEGF和VEGFR兩種免疫組化檢測，VEGF和VEGFR工作濃度均為1∶50，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 VEGF表達(dá)主要見于腫瘤細(xì)胞漿中，為胞漿內(nèi)棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較少；VEGFR主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而肝癌細(xì)胞漿呈弱陽性表達(dá)。參照文獻(xiàn)運(yùn)用高倍鏡（@200）于染色密集區(qū)每片隨機(jī)計數(shù)3個視野，每視野計分為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率的得分之和：無染色0分，弱染色（淺黃）1分，中等染色（棕黃）2分，強(qiáng)染色（棕褐色）3分；陽性細(xì)胞率<5%計0分，5%~25%計1分，26~50%計2分，>50%計3分。各視野得分的平均值作為最終得分：0分為陰性，1~2分為弱陽性，3~4分為中度陽性，5~6分為強(qiáng)陽性，并把陰性和弱陽性合并作為陰性結(jié)果，而中陽性及強(qiáng)陽性合并作為陽性結(jié)果[3]。本組76例中無陰性表達(dá)，故將弱陽性作為陰性統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。壽命表法計算無瘤生存率，單因素生存時間對比分析采用對數(shù)秩和檢驗，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料及兩因素相關(guān)采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者手術(shù)2年后無瘤生存率 全部76例術(shù)后隨訪2年以上，無失訪者，術(shù)后1年有29例復(fù)發(fā)，術(shù)后2年復(fù)發(fā)19例，按壽命表法計算術(shù)后第1、2年累計平均無瘤生存率分別為61.85%±5.57%、40.97%±5.63%。

2.2 分析肝癌術(shù)后生存時間的影響因素 臨床中影響肝癌患者術(shù)后生存時間的因素很多，根據(jù)臨床實際情況主要分析年齡、性別、有無肝硬化、有無病毒性肝炎、術(shù)前AFP水平、術(shù)前肝癌在肝內(nèi)是否轉(zhuǎn)移、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫塊包膜情況、腫瘤分化程度和VEGF、VEGFR的表達(dá)水平與術(shù)后生存時間的關(guān)系，先逐個做單因素分析對數(shù)秩和檢驗，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)性別、年齡、病毒性肝炎、肝硬化、術(shù)前AFP水平及腫瘤分化程度對術(shù)后生存時間影響無統(tǒng)計學(xué)差異；而VEGF、VEGFR陽性表達(dá)和術(shù)前肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫瘤有無假包膜對生存時間的影響有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。

2.3 VEGF、VEGFR與轉(zhuǎn)移、腫塊體積、腫塊數(shù)目及腫瘤包膜之間的相互關(guān)系 將免疫組化染色的標(biāo)本與已知陰性片對照比較，發(fā)現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)61例，陽性率80.3%，VEGFR陽性表達(dá)67例，陽性率88.2%。對肝癌術(shù)后生存時間有明顯影響的六項指標(biāo)中，肝癌體積大小、轉(zhuǎn)移情況、有無包膜與VEGF、VEGFR的陽性表達(dá)密切相關(guān) （P<0.05）， 說明VEGF、VEGFR陽性表達(dá)者能促進(jìn)血管快速形成，加速腫瘤生長，增加腫瘤的侵襲性，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

2.4 VEGF、VEGFR的表達(dá)與術(shù)后2年復(fù)發(fā)的關(guān)系將術(shù)后第1、2年后復(fù)發(fā)患者的VEGF、VEGFR表達(dá)的情況進(jìn)行χ2檢驗，以了解之間的關(guān)系，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR的陽性表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)（P<0.05），說明 VEGF、VEGFR 陽性表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的可能性明顯增大，無瘤生存時間短。

2.5 VEGF、VEGFR表達(dá)的關(guān)系 將VEGF、VEGFR的表達(dá)情況進(jìn)行相互比較分析，應(yīng)用χ2檢驗發(fā)現(xiàn)VEGF、VEGFR的表達(dá)相互之間具有相關(guān)性 （P<0.05），說明在肝癌組織中VEGF、VEGFR二者之間的表達(dá)具有相互促進(jìn)作用。

3 討 論

正常情況下，VEGF在人體內(nèi)維持在一個較低水平，在生理需要的情況下，如胚胎形成、骨骼生長等時VEGF表達(dá)增加，促使血管快速形成，滿足機(jī)體的生長發(fā)育，但在病理狀態(tài)下，如腫瘤的形成過程中腫瘤細(xì)胞也表達(dá)大量的VEGF，形成血管網(wǎng)，以促進(jìn)腫瘤的快速擴(kuò)展和蔓延。這種情況在肝癌組織中表現(xiàn)的更加顯著，臨床及病理均已證實肝癌是一種富血管腫瘤，在肝癌組織中存在大量的腫瘤新生血管。大量資料表明VEGF是腫瘤血管形成的關(guān)鍵生長因子，在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，VEGF表達(dá)程度與肝癌組織內(nèi)微血管密度一致，并在肝癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[4]。在本組76例中無陰性表達(dá)，VEGF呈陽性表達(dá)有61例，陽性率80.3%，比其它文獻(xiàn)結(jié)果略高[2，4]，估計可能與樣本選擇、樣本數(shù)大小、檢測方法、對照標(biāo)準(zhǔn)等不同有關(guān)，但結(jié)論還是一致。在本組肝癌組織中VEGF呈高表達(dá)，筆者推測VEGF陽性表達(dá)越強(qiáng)，腫瘤新生血管網(wǎng)越多，腫塊生長越快，本組61例陽性表達(dá)患者中有56例為直徑>5 cm者，筆者考慮這種VEGF高表達(dá)促血管生成及腫瘤生長的作用可能是腫瘤在快速生長過程中由于腫塊缺血缺氧誘導(dǎo)刺激癌細(xì)胞通過自分泌和旁分泌途徑表達(dá)大量VEGF的緣故，這與其它文獻(xiàn)報道相符[1，2]，其余15例統(tǒng)計為陰性者其實也呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)，但大部分是直徑<5 cm的患者，術(shù)前影像學(xué)檢查即顯示為少血供腫瘤，這也從另一面說明了這一點。

原發(fā)性肝癌號稱為“癌腫之王”，主要是從肝癌的生物學(xué)行為角度說的，因肝癌惡性度高，侵襲性強(qiáng)，術(shù)后易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，因而長期生存率低。近年來對于肝癌復(fù)發(fā)的預(yù)測做了大量研究，有許多指標(biāo)可以用于預(yù)測復(fù)發(fā)和生存時間，除了一些臨床及病理特征對肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及生存時間的影響可以作為預(yù)測項目外，VEGF作為預(yù)測指標(biāo)正日漸得到臨床的認(rèn)可[6]。本文資料顯示VEGF、VEGFR陽性表達(dá)和術(shù)前肝癌的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況、腫塊大小、腫塊數(shù)目、腫瘤有無包膜等因素對復(fù)發(fā)和生存時間的影響明顯，而腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、有無假包膜等與VEGF、VEGFR的陽性表達(dá)相互之間也密切相關(guān)，說明VEGF、VEGFR高表達(dá)能促進(jìn)血管快速形成，加速腫瘤生長，促進(jìn)轉(zhuǎn)移，統(tǒng)計全組復(fù)發(fā)情況時發(fā)現(xiàn)術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)患者與VEGF、VEGFR的陽性表達(dá)緊密相聯(lián)，存在顯著的相關(guān)性，據(jù)此并結(jié)合其他文獻(xiàn)研究結(jié)果得出結(jié)論VEGF、VEGFR是影響肝癌發(fā)展方向的重要因素之一，可以作為術(shù)后預(yù)測復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。

在腫瘤組織中VEGF、VEGFR是通過自分泌和（或）旁分泌途徑，聯(lián)合調(diào)控腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖和血管形成的，并且VEGF、VEGFR的表達(dá)相互關(guān)聯(lián)。VEGF和VEGFR類型雖多種多樣，但許多研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中VEGF的表達(dá)主要是VEGF165，主要分布于肝癌細(xì)胞漿內(nèi)，VEGFR表達(dá)以VEGFR-2為主，主要分布在巨噬細(xì)胞和腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，只有二者結(jié)合才能產(chǎn)生促血管形成、促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效應(yīng)[1，4]。通過本組76例肝癌標(biāo)本的研究筆者發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)主要見于肝癌細(xì)胞漿中，免疫組化染色為胞漿內(nèi)棕黃色粗大顆粒，部分胞膜也有表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較少，而VEGFR主要在肝癌組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，癌細(xì)胞漿僅呈弱陽性表達(dá)，并且在61例VEGF陽性患者與67例VEGFR陽性患者中，有56例同時呈陽性表達(dá)，因此筆者認(rèn)為VEGF誘導(dǎo)的血管生成和腫瘤生長、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中與VEGFR在肝癌組織血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)也是密切相關(guān)的。

總之肝癌的生長離不開持續(xù)和廣泛的血管生成，抑制新生血管可能成為治療肝癌的另一種有效的新方法。由于VEGF的表達(dá)與血管生成和肝癌細(xì)胞生長都密切相關(guān)，因而抑制和阻斷肝癌細(xì)胞所分泌的VEGF的生物活性對遏制肝癌生長和轉(zhuǎn)移，提高肝癌術(shù)后生存時間等方面有重要意義。

[1]秦將均，柯麗琴，涂 蓉.肝癌的VEGF及其受體的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（6）：1045-1046.

[2]鄭青平，陳龍華，石玉生，等.肝癌組織VEGF、HIF-1α和MMP-2 表達(dá)的臨床研究[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2008，30（3）：308-311.

[3]Gohji K,Katsuoka Y,Okamoto M,et al.Human heparanase:roles in invasion and metastasis of cancer[J].Hinyokika Kiyo,2000,46(10):757-762.

[4]梁 軍，于 麗，沈方臻.肝癌中血管生成VEGF及其受體水平與預(yù)后的關(guān)系[J]. 中國腫瘤臨床，2004，31（4）：197-200.

[5]楊文軍，康 博，孫德文，等.血管內(nèi)皮生長因子及受體與腫瘤研究概況[J]. 廣東牙病防治，2005，13（2）：153-155.

[6]黃潔夫.腹部外科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.1196-1201.