血管性癡呆大鼠模型的改良

竇金金，謝寧，吳頌，史瑞，張真

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，哈爾濱150040;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院急癥部)

改良2-血管阻斷法(2-VO)+硝普鈉降壓是血管性癡呆(VD)研究中常用的模型之一［1］。此法制作模型可重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，其優(yōu)點(diǎn)為手術(shù)操作簡單，對動(dòng)物創(chuàng)傷較小，易于恢復(fù)，尤其是以學(xué)習(xí)記憶能力低下為主要特點(diǎn)，與臨床“血管性癡呆”的發(fā)病過程相似，存活率較高。適用于研究血管性癡呆的病理生理機(jī)制和評價(jià)藥物的作用。傳統(tǒng)方法分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，腹腔注射硝普鈉造成低血壓，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，再通10 min，如此反復(fù)2次，撤線，縫合傷口。本文擬對傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，探討延長雙側(cè)頸動(dòng)脈夾閉時(shí)間并增加夾閉次數(shù)建立VD模型的成功率。

1 材料和方法

1.1 模型的復(fù)制 將購買的雄性Wistar大鼠(由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供)20只，體質(zhì)量220～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為腦缺血模型組、假手術(shù)對照組，每組10只。各組大鼠手術(shù)前后均常規(guī)飼養(yǎng)。將大鼠用10%烏拉坦(1 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，模型組在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉(北京雙鶴制藥廠，2.5 mg/kg，用無菌蒸餾水溶解)，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA，20 min 后，再通 10 min，再夾閉 20 min，再通10 min，再夾閉20 min再通后縫合傷口，術(shù)后于頸動(dòng)脈傷口處均勻撒入青霉素鈉鹽。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷CCA及注射硝普鈉。在全部造模過程中保持動(dòng)物直腸溫度在37℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護(hù)作用。

1.2 行為學(xué)測定 術(shù)后觀察大鼠一般情況及成活率，于術(shù)后28 d使用Morris水迷宮對大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力的測定［2］。

定位航行試驗(yàn):在水池里注入清水，使水面高出平臺(tái)1～2 cm，水溫控制在(24±2)℃左右，水池等分為4個(gè)象限(從右上、左上、左下、右下分別是一至四象限)。將平臺(tái)放在第四象限中間，在其他三個(gè)象限任選一點(diǎn)面向水池池壁將鼠放入水中，試驗(yàn)歷時(shí)4 d，每天上午每個(gè)象限各測試1次，每次測試1 min。若大鼠在1 min之內(nèi)尚未找到平臺(tái)，則將鼠拿到平臺(tái)上并使它在上面站10 s，則其潛伏期為1 min;若鼠在1 min之內(nèi)找到平臺(tái)，也讓其在平臺(tái)上站10 s，方結(jié)束一次訓(xùn)練，如此訓(xùn)練4 d。記錄大鼠分別在三個(gè)象限找到平臺(tái)所需時(shí)間(即潛伏期)，計(jì)算平均值。

空間探索試驗(yàn):在行為學(xué)測試第5天下午，定位航行試驗(yàn)結(jié)束后，撤除平臺(tái)，然后從原始平臺(tái)對側(cè)象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中，測其1 min內(nèi)經(jīng)過原始平臺(tái)位置的次數(shù)以及平臺(tái)象限游程占總游程的百分比。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 行為學(xué)測試完成后，斷頭處死動(dòng)物，取腦組織固定，取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，然后做Nissl染色，光鏡觀察海馬細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件，數(shù)據(jù)分析運(yùn)用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 1周內(nèi)體質(zhì)量明顯減輕，活動(dòng)減少，飲食差，毛發(fā)蓬松且易脫落。手術(shù)28 d后，模型組存活9只，存活率與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 行為學(xué)指標(biāo) 在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組路徑比正常組明顯延長，潛伏期明顯延長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少、平臺(tái)象限游程占總游程的百分比也顯著降低，見表1，2。

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s，m)

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s，m)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(shù)(只) 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 10 25.39 ±5.92 21.52 ±7.04 17.08 ±3.97 10.72 ±4.80模型組 9 48.59 ±6.27a45.92 ±8.01a41.12 ±5.80a35.65 ±4.37a

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(shù)(只) 穿越平臺(tái)次數(shù)平臺(tái)象限游程占總游程的百分比(%)對照組10 6.62 ±2.23 39.47 ±8.07模型組 9 3.50 ±1.61a 26.45 ±4.31a

2.3 病理學(xué)變化 光鏡下觀察:對照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密有序，細(xì)胞核圓而大，邊界及核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，而且均勻分布，神經(jīng)纖維排列整齊;模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞大小排列紊亂、稀疏，細(xì)胞間隙增大，胞漿內(nèi)尼氏體減少或消失，有數(shù)量不等的小空泡，呈均勻淡藍(lán)色，細(xì)胞核變小，結(jié)構(gòu)不清，核仁消失，神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯。

3 討論

VD是由一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的癡呆綜合征。患者表現(xiàn)為記憶及認(rèn)知等功能障礙綜合征，不僅嚴(yán)重?fù)p害患者的健康，影響患者的生命質(zhì)量，也給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)［3-4］。在我國11個(gè)城市流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60歲以上人群中VD的患病率為324/10萬人口，老年性癡呆(AD)為238/10萬人口，VD占各類癡呆的第1位。VD患者的平均生存時(shí)間為41個(gè)月，5年內(nèi)死亡率達(dá)60%以上［5］。并且隨著人類社會(huì)的老齡化，VD已是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的重要課題，由于對本病的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，亦缺少治療本病的特效藥物，因此建立理想的VD動(dòng)物模型對于探明VD的病因、病理過程以及尋找和篩選防治藥物具有重要意義。

我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只要硝普鈉注射量準(zhǔn)確、可靠，操作者手法熟練同時(shí)環(huán)境溫度恒定，適當(dāng)延長雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉的時(shí)間并且增加夾閉次數(shù)沒有嚴(yán)重影響大鼠的成活率，并且在術(shù)后通過對Morris水迷宮檢測，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，空間記憶障礙明顯，成功建造了大鼠癡呆模型。形態(tài)學(xué)觀察可見明顯的CA1區(qū)錐體細(xì)胞的變性、死亡、甚至丟失，這一變化印證了行為學(xué)的結(jié)果。而且動(dòng)物沒有明顯的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷表現(xiàn)，存活率較高。

［1］ 王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬血管性癡呆模型的改進(jìn)［J］.中國病理生理雜志，2000，16(10):914-916.

［2］ Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nature Protocols，2006，1(2):848.

［3］ 俞德彩，張艷艷，劉巧玲.血管性癡呆與頸動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性研究［J］.中國臨床保健雜志，2005，8(2):118-119.

［4］ 何靜，謝道俊.血管性癡呆的中醫(yī)藥治療［J］.中國臨床保健雜志，2009，12(1):94-96.

［5］ Bomebroke M，Breteler NM.Epidemiology of non-AD dementias［J］.Clin Neurosic Res，2004，3(6):349-361.