劍門(mén)火腿菌相構(gòu)成及主要腐敗菌特性分析

李欣蔚，遲原龍，賈冬英，黃 灝，姚 開(kāi)*

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.成都大學(xué) 師范學(xué)院，四川 成都 610106）

劍門(mén)火腿是以豬后腿為原料在自然或人工控溫條件下進(jìn)行腌制和長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而成的具有特殊風(fēng)味、色澤與質(zhì)地的肉制品，是烹調(diào)美味佳肴的上乘原料，但其在貯藏過(guò)程中微生物會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)。國(guó)內(nèi)外對(duì)發(fā)酵肉制品中微生物的種群及其變化已進(jìn)行了較多研究，李平蘭等[1]發(fā)現(xiàn)宣威火腿中的主要優(yōu)勢(shì)菌是葡萄球菌、微球菌和霉菌，且表層數(shù)量明顯多于內(nèi)部；甄宗園等[2]對(duì)金華火腿發(fā)酵過(guò)程中微生物區(qū)系的研究顯示，葡萄球菌和乳酸菌是火腿內(nèi)部的優(yōu)勢(shì)菌；PAARUPT等[3]研究認(rèn)為，微球菌是西班牙干腌火腿中數(shù)量最多的微生物?；谠?、工藝和環(huán)境等不同因素會(huì)影響發(fā)酵火腿中微生物的組成和比例，加之目前有關(guān)劍門(mén)火腿的微生物特性研究尚無(wú)報(bào)道，因此對(duì)劍門(mén)火腿的菌相構(gòu)成及其主要腐敗菌的特性進(jìn)行了分析，其研究結(jié)果可為傳統(tǒng)發(fā)酵火腿的防腐保質(zhì)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

劍門(mén)火腿由四川劍閣某火腿廠提供；MSA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)公司提供，生理生化鑒定所用培養(yǎng)基（氧化酶、接觸酶、葡萄糖發(fā)酵、蛋白酶、脂肪酶、耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)粘、產(chǎn)酸、產(chǎn)氨、產(chǎn)氣、產(chǎn)H2S）的制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

儀器UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，PHS-2C型酸度計(jì)等。

1.3 方法

1.3.1 火腿的菌相分析

剔除火腿表面氧化層，分別隨機(jī)取火腿表層及其2.0cm以下的肌肉組織，取剪碎后混合的適量樣品，加入定量的無(wú)菌生理鹽水，勻漿后進(jìn)行梯度稀釋。取適當(dāng)稀釋度的菌懸液，分別接入不同選擇性培養(yǎng)基中于適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其中MSA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、VRBDA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)48h，孟加拉紅培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)96h。對(duì)不同選擇性培養(yǎng)基中的典型菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（平行重復(fù)3次，取其平均值）、分離純化、形態(tài)及生理生化特征檢測(cè)。

1.3.2 菌株耐鹽性測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于NaCl濃度為9.0%、12%、15%（w/v）的MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.3 菌株耐亞硝酸鹽性測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于含有150mg/kg NaNO2的MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.4 菌株耐酸性測(cè)定

將分離得到的葡萄球菌和微球菌分別接種于pH值為4.5的MSA液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)其OD600值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.5 菌株產(chǎn)粘能力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于MSA和MRS固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，接種環(huán)挑取菌落判斷其粘性。

1.3.6 菌株產(chǎn)酸能力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定其pH值，以未接菌株的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.3.7 菌株產(chǎn)氨能力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于產(chǎn)氨培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，滴加3～5滴氨試劑，觀察沉淀生成情況，產(chǎn)生黃色或棕紅色沉淀者為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3.8 菌株產(chǎn)氣能力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，杜氏小管內(nèi)有氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3.9 菌株產(chǎn)H2S能力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別穿刺接種于H2S培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d，沿穿刺線產(chǎn)生黑色沉淀的為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3.10 菌株蛋白酶活力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取0.1mL菌液涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5d，于菌落周?chē)渭?0%（v/v）三氯乙酸，觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈并測(cè)其直徑d（d<0.1cm為產(chǎn)酶能力弱，d：0.1cm～0.5cm為產(chǎn)酶能力中等，d>0.5cm為產(chǎn)酶能力強(qiáng)）。

1.3.11 菌株脂肪酶活力測(cè)定

將分離得到的細(xì)菌菌株分別接種于MSA和MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取0.1mL菌液涂布于豬背脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)5d，觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈并測(cè)其直徑d。

2 結(jié)果與分析

2.1 劍門(mén)火腿的菌相構(gòu)成

分別對(duì)MSA和MRS培養(yǎng)基上的典型菌落進(jìn)行分離和純化，依據(jù)BROWN MH等[5]推薦的肉品中微生物的鑒定程序?qū)ζ溥M(jìn)行生理生化檢測(cè)，并對(duì)孟加拉紅培養(yǎng)基上的典型菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)的觀察。結(jié)果顯示，由MSA培養(yǎng)基分離出3株葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）和1株微球菌（C-1），由MRS培養(yǎng)基分離出2株乳酸菌（L-1和L-2），由孟加拉紅培養(yǎng)基分離出2株霉菌（M-1和M-2）和2株酵母菌（Y-1和Y-2）。

劍門(mén)火腿表面和內(nèi)部肌肉組織中的菌相構(gòu)成如圖1所示?？梢钥闯?，火腿中微生物主要由葡萄球菌、微球菌和酵母菌構(gòu)成，且表層數(shù)量明顯多于內(nèi)部?；鹜戎忻咕饕植加谄浔砻?，且數(shù)量較少（僅為70cfu/g），結(jié)果與宣威火腿中的霉菌數(shù)量相差較大[1]，這可能與火腿表面氧化層已剔除有關(guān)；火腿表層的細(xì)菌主要為葡萄球菌和微球菌，而內(nèi)部主要由葡萄球菌和乳酸菌構(gòu)成，該結(jié)果與李平蘭等[1]和甄宗圓[2]的研究結(jié)論相一致，這是由于火腿表面的高鹽環(huán)境抑制了某些乳酸菌的生長(zhǎng)，而火腿內(nèi)部致密的組織和無(wú)氧的環(huán)境不利于微球菌生長(zhǎng)的緣故；酵母菌在劍門(mén)火腿中也占有一定的比例；劍門(mén)火腿中基本無(wú)腸桿菌檢出，這是由于火腿中的高鹽量（8.5%～9.0%）抑制了腸道菌的生長(zhǎng)，或葡萄球菌和乳酸菌對(duì)腸桿菌具有一定的限制作用[3]。

圖1 劍門(mén)火腿的菌相構(gòu)成Fig.1 Microflora composition in Jianmen ham

2.2 劍門(mén)火腿中菌株的耐鹽性

劍門(mén)火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌于不同NaCl濃度下的生長(zhǎng)量見(jiàn)表1?？梢钥闯?，菌株的生長(zhǎng)量隨NaCl濃度的增加而降低；3種菌在9.0%NaCl下均有一定生長(zhǎng)，但在17%NaCl下僅有葡萄球菌S-1和微球菌C-1生長(zhǎng)，且菌株C-1的OD600值僅為0.026，表明其生長(zhǎng)很弱。由于劍門(mén)火腿的含鹽量為8.5%～9.0%，故在此條件下3種菌都能正常生長(zhǎng)，其中葡萄球菌S-1的耐鹽能力最強(qiáng)。

表1 不同NaCl 濃度時(shí)菌株的吸光值Table 1 OD600of strains in different concentrations of NaCl

2.3 劍門(mén)火腿中菌株的耐亞硝酸鹽能力

劍門(mén)火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌在NaNO2濃度為150mg/kg下的生長(zhǎng)量見(jiàn)表2。可以看出，6株菌均具有一定的亞硝酸鹽耐受性，其中葡萄球菌（S-1、S-2和S-3）對(duì)亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的耐受性，而微球菌C-1和乳酸菌（L-1和L-2）對(duì)亞硝酸鹽的耐受性相對(duì)較弱。

表2 含亞硝酸鹽培養(yǎng)液中菌株的吸光值Table 2 OD600of strains in nitrite-containing media

2.4 劍門(mén)火腿中菌株的耐酸能力

劍門(mén)火腿中葡萄球菌及微球菌于pH值為4.5培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)量見(jiàn)表3?？梢钥闯觯咸亚蚓哂幸欢ǖ哪退嵝?，其中菌株S-1的耐酸性最強(qiáng)；微球菌C-1的耐酸性較差。

表3 pH4.5 培養(yǎng)液中菌株的吸光值Table 3 OD600of strains in pH 4.5 media

2.5 劍門(mén)火腿中菌株的致腐特性

劍門(mén)火腿中葡萄球菌、微球菌及乳酸菌的致腐特性見(jiàn)表4?？梢钥闯?，葡萄球菌和微球菌均不產(chǎn)粘、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，且產(chǎn)酸能力較弱；葡萄球菌S-3可產(chǎn)蛋白酶，而菌株S-1和S-2及C-1均不產(chǎn)生蛋白酶；葡萄球菌和微球菌都具有產(chǎn)脂肪酶的能力，其中菌株S-2和S-3及C-1具有中等的產(chǎn)脂肪酶能力，這與劉曉強(qiáng)[4]對(duì)云南火腿中葡萄球菌和微球菌的主要特性分析結(jié)果基本相同。

表4 劍門(mén)火腿中主要細(xì)菌的致腐特性Table 4 Spoilage capabilities of main bacteria in Jianmen ham

乳酸菌L-1不產(chǎn)粘，而菌株L-2具有產(chǎn)粘特性；菌株L-1和L-2均不產(chǎn)氨、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，但產(chǎn)酸能力均較強(qiáng)；菌株L-2具有一定的產(chǎn)蛋白酶能力；2株乳酸菌均具有一定產(chǎn)脂肪酶能力，其中菌株L-2的產(chǎn)脂肪酶能力更強(qiáng)。微生物產(chǎn)粘可能是其分解蛋白質(zhì)的緣故，不僅破壞肉品的內(nèi)部組織，而且影響產(chǎn)品外觀，進(jìn)而造成其腐敗變質(zhì)；而脂肪在微生物產(chǎn)生的脂肪酶作用下發(fā)生水解，也會(huì)加速肉品的酸敗變質(zhì)。此外，乳酸菌在同型發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸降低了環(huán)境的pH值，使肉品發(fā)生腐敗而產(chǎn)生酸味[6]。

綜上所述，可以認(rèn)為劍門(mén)火腿中的葡萄球菌S-3及乳酸菌L-2是導(dǎo)致其腐敗的主要微生物。

3 結(jié)論

劍門(mén)火腿的菌相是由種類(lèi)不同的微生物所構(gòu)成。其中，葡萄球菌、微球菌和酵母菌的數(shù)量占優(yōu)，且表層數(shù)量明顯高于其肌肉組織內(nèi)部；乳酸菌主要分布于火腿內(nèi)部，霉菌主要存在于火腿表層。主要細(xì)菌的致腐特性分析結(jié)果顯示，葡萄球菌S-3和乳酸菌L-2是導(dǎo)致劍門(mén)火腿腐敗的主要菌株。

[1]李平蘭，沈清武，呂燕妮，等.宣威火腿成熟產(chǎn)品中主要微生物菌相構(gòu)成分析[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2003，15（5）：262-263.

[2]甄宗圓.金華火腿微生物區(qū)系研究[D].重慶：西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004.

[3]PAARUP T,NIETO JC,PELAEZ C,et al.Microbiological and physico-chemical characterization of deep spoilage in Spanish dry-cured hams and characterization of isolatedEnterobacteriaceaewith regard to salt and temperature tolerance[J].Eur Food Res Technol，1999，209（5）：366-371.

[4]劉曉強(qiáng).云南火腿中菌種的分離篩選及在發(fā)酵火腿中的應(yīng)用[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[5]BROWNMH.Meat Microbiology[M].New York:Applied Science Publishers LTD，1982：474-475.

[6]張春江，王海燕，羅 欣.微生物引起的肉與肉制品的腐敗[J].微生物與食品，2001（6）：16-19.