假單胞菌B41產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件的研究

廖 敏，陳希文，姜立春，阮期平*

（綿陽(yáng)師范學(xué)院 分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621000）

竹原纖維是一種全新概念的涼爽、舒適性纖維。竹原纖維細(xì)而中空，橫截面布滿橢圓形孔隙，可以在瞬間吸收并蒸發(fā)水分，有很高的吸汗能力和較好的透氣性[1]。我國(guó)是世界上竹的種植大國(guó)，為制作竹原纖維提供充足的原料。

現(xiàn)有的竹原纖維制取工藝如機(jī)械加工、機(jī)械化學(xué)聯(lián)合加工和化學(xué)加工3種方法都不能符合對(duì)竹原纖維開(kāi)發(fā)的要求，真正綠色的竹原纖維的開(kāi)發(fā)需要尋求新的方法[2]。竹纖維的單纖維長(zhǎng)度很短，長(zhǎng)寬比遠(yuǎn)低于大麻、亞麻纖維，因此如果對(duì)竹纖維進(jìn)行脫膠處理，脫膠工藝也應(yīng)采用與黃麻纖維相類似的輕度脫膠方式，去除部分膠質(zhì)以改善纖維可紡性，并保留部分膠質(zhì)，利用殘膠將極短的單纖維粘連起來(lái)，保證一定的纖維長(zhǎng)度，滿足紡紗工藝要求。生物技術(shù)脫膠的關(guān)鍵技術(shù)之一是分離到高產(chǎn)果膠酶菌株，用于竹原纖維制作過(guò)程中脫膠工序[3]。

本實(shí)驗(yàn)室從北川傳統(tǒng)漚竹池入手，通過(guò)初篩、復(fù)篩等手段，篩選出竹原纖維脫膠菌株——假單胞菌B41（Pseudomonas.sp）。該菌生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)酶發(fā)酵周期短，具有工業(yè)推廣的價(jià)值。本文以假單胞菌B41為出發(fā)菌株，對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化進(jìn)行了初步研究，為其深入研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，將解決工業(yè)生產(chǎn)中利用生物技術(shù)制作竹原纖維的部分問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：假單胞菌B41（Pseudomonas.sp），4℃冰箱保藏，由綿陽(yáng)師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化鈉5.0g/L，瓊脂20.0g/L，pH值為7.0，0.1MPa、121℃滅菌20min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH值為7.0，0.1MPa、121℃滅菌20min。

1.3 試驗(yàn)方法

種子培養(yǎng)：斜面活化后接種，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、30℃培養(yǎng)24h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：250mL錐形瓶裝液量30mL，接種量5%，搖床轉(zhuǎn)速180r/min、30℃培養(yǎng)24h。

粗酶液制備：將搖瓶發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液于4℃、5000r/min離心15min，取上清液作為果膠酶活力待測(cè)粗酶液。

酶活測(cè)定方法[4]：采用DNS分光光度計(jì)法，取1%果膠溶液（磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液配制，pH值為5.0）1mL，加入1mL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵粗酶液，40℃水浴反應(yīng)30min，然后加人2.0mL DNS試劑，沸水浴加熱5min，冷卻后定容至25mL。取經(jīng)加熱煮沸5min的失活酶液代替粗酶液作空白。波長(zhǎng)540nm處測(cè)吸光度值。酶活力單位定義：果膠酶降解果膠底物每分鐘催化果膠水解生成1μg半乳糖醛酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源種類及濃度的對(duì)產(chǎn)酶的影響

因?yàn)楣z酶屬于誘導(dǎo)酶，需要在果膠物質(zhì)存在的碳源條件下才能產(chǎn)生[5]。所以選取含果膠的天然物質(zhì)（如桔皮粉、麩皮、玉米粉、稻草桿）為碳源[6]，以20.0g/L的量等量代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的果膠制成培養(yǎng)基，搖床發(fā)酵，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明，以桔皮粉為碳源效果最好。進(jìn)一步研究桔皮粉添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖2）表明，當(dāng)桔皮粉添加量為15g/L時(shí)酶活力最高。

2.2 氮源種類及濃度的影響

在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，采用同樣的方法考察不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。試驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白胨作為氮源時(shí)酶活明顯比其他氮源高。進(jìn)一步研究蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)添加量為12.5g/L時(shí)酶活最高。

圖2 桔皮粉添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of additional amount of citrus peel powder on pectinase production from B41

圖3 氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on pectinase production from B41

圖4 蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)酶影響Fig.4 Effect of addition of peptone on pectinase production from B41

2.3 金屬離子的影響

無(wú)機(jī)鹽的重要功能是構(gòu)成細(xì)胞組成部分并維持酶的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、氫離子濃度、氧化還原電位等[7]。而微量的無(wú)機(jī)鹽往往與酶活性有關(guān)，或參與酶的組成，或是許多酶的調(diào)節(jié)因子[8]。在以上碳源氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同種類的無(wú)機(jī)鹽，測(cè)定果膠酶酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。試驗(yàn)結(jié)果表明，金屬離子Fe2+能提高酶的活力，而Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+對(duì)菌種產(chǎn)果膠酶活力有不同程度的抑制作用。進(jìn)一步研究Fe2+對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果（圖6）表明，當(dāng)添加量為0.5g/L時(shí)酶活最高。

2.4 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

基于上述優(yōu)化條件，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0接種后培養(yǎng)36h測(cè)定不同pH值時(shí)的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖7。當(dāng)初始pH值為6.0時(shí)，發(fā)酵液酶活力最大，高于8.0之后，酶活力顯著下降。

圖5 金屬離子種類對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of types metal ions on pectinase production from B41

圖6 Fe2+添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of addition of Fe2+on pectinase production from B41

圖7 初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH value on pectinase production from B41

2.5 最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取桔皮粉、蛋白胨、FeSO4、初始pH值4因素做L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析見(jiàn)表3。

表1 優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基試驗(yàn)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimized fermentation medium

表2 優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for optimized fermentation medium

表3 優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment result of medium optimization

由表2可以看出，各因素的顯著性關(guān)系為A>D>C>B，得出最優(yōu)試驗(yàn)方案為A3B1C3D2。由于正交試驗(yàn)的最優(yōu)方案A3B1C3D2就是正交試驗(yàn)表中第7號(hào)試驗(yàn)。因此當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基為A3B1C3D2，即桔皮粉20.0g/L，蛋白胨10.0g/L，F(xiàn)eSO40.5g/L，初始pH值為5.5，果膠酶酶活可達(dá)710U/mL。

2.6 裝液量的影響

圖8 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of liquid filling rate on pectinase production from B41

在2.5確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下，選取250mL三角瓶搖床培養(yǎng)，觀察不同裝液量對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響[9]，結(jié)果見(jiàn)圖8，裝液量為50mL時(shí)，酶活力最大，隨著裝液量的升高，酶活力逐漸下降。說(shuō)明菌株B41是好氧菌，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，對(duì)氧的需求較高。

2.7 接種量的影響

將培養(yǎng)24h的液體菌種接種到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察接種量對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響。結(jié)果（圖9）可知，當(dāng)接種量為3%時(shí)，果膠酶活力最高。

圖9 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of inoculum on pectinase production from B41

2.8 發(fā)酵溫度的影響

取250mL三角瓶，裝液體最佳發(fā)酵培養(yǎng)基50mL，按3%接種量，在不同溫度下?lián)u床培養(yǎng)，觀察發(fā)酵溫度對(duì)B41產(chǎn)果膠酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。結(jié)果表明，B41產(chǎn)果膠酶活力隨發(fā)酵溫度的升高而提高，但超過(guò)30℃，果膠酶活力逐漸降低，初步確定最佳產(chǎn)酶發(fā)酵溫度為30℃。

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of fermentation temperatures on pectinase production from B41

2.9 發(fā)酵時(shí)間的影響

在上述培養(yǎng)條件下，選取不同的發(fā)酵時(shí)間，測(cè)定果膠酶活力，觀察發(fā)酵時(shí)間對(duì)B41產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖11。由圖11看出，發(fā)酵時(shí)間在28h時(shí)，酶活力趨于最高，32h時(shí)達(dá)到最高，此后相對(duì)維持在一個(gè)水平線。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)40h，酶活力下降的趨勢(shì)十分明顯。

2.10 最佳產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取裝液量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4因素做正交試驗(yàn)[10]，結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

圖11 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of fermentation time on pectinase production from B41

表4 優(yōu)化產(chǎn)酶條件試驗(yàn)正交試驗(yàn)因素水平Table 4 Factors and levels of orthogonal test for enzyme production condition optimization

表5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal test for enzyme production condition optimization

由表5可以看出，各因素的顯著性關(guān)系為A>B>D>C，得出最優(yōu)組合為A2B1C2D2。由于正交試驗(yàn)的最佳方案是A2B1C2D3即正交試驗(yàn)表中第4號(hào)試驗(yàn)，為進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)推論結(jié)果，又進(jìn)行了最優(yōu)組合與最佳方案的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。從表7得知，預(yù)測(cè)的最優(yōu)組合與最佳試驗(yàn)方案相比，最優(yōu)組合條件下所產(chǎn)果膠酶酶活力更高。因此當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)條件為A2B1C2D2，即裝液量50mL，接種量2%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間32h，果膠酶酶活可達(dá)739U/mL。

表6 優(yōu)化產(chǎn)酶條件正交試驗(yàn)方差分析Table 6 Variance analysis of variance of orthogonal experiment result of enzymes production

表7 正交試驗(yàn)驗(yàn)證Table 7 Verification of orthogonal experiment result

3 結(jié)論

經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)分析，得到最優(yōu)的假單胞菌B41液態(tài)搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵培養(yǎng)基為桔皮粉20g/L，蛋白胨10g/L，F(xiàn)eSO40.5g/L，初始pH值5.5。最佳發(fā)酵條件為裝液量50mL，接種量2%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間32h。在此優(yōu)化條件下，果膠酶活力為739U/mL。

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