紫紅曲霉液態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素培養(yǎng)基的優(yōu)化

李大鵬，孫文紅，高玉榮，王宇寧

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319;2.大慶家良食品有限公司，黑龍江 大慶 163515）

紅曲紅色素是紅曲霉在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的天然紅色素，無(wú)毒、無(wú)副作用，屬于蒽醌衍生物，分子式為C22H24O5，溶于乙醇、水，被廣泛用于清酒、醬油、腐乳、豆醬、魚(yú)、肉、糕點(diǎn)等食品的著色，安全性高，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)的著色性好[1]，因此目前紅曲和紅曲紅色素的市場(chǎng)需求量正日益擴(kuò)大。目前紅曲紅色素的生產(chǎn)方法有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵2種方法。紅曲紅色素傳統(tǒng)發(fā)酵以固態(tài)發(fā)酵為主，由于液態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短，發(fā)酵條件容易控制，不容易污染等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)開(kāi)始進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素的研究[2-4]。

紅曲紅色素是一種混合色素，主要包括紅色素和黃色素，隨著紅色素與黃色素比值（色調(diào)）的增大，色素顏色逐漸加深呈現(xiàn)紅色，因此，色調(diào)對(duì)紅曲紅色素的質(zhì)量也有重要的影響。在前人對(duì)紅曲紅色素生產(chǎn)的研究中，只以紅色價(jià)為指標(biāo)，而未考慮色調(diào)對(duì)紅曲紅色素質(zhì)量的影響[2-6]。目前為止，還未見(jiàn)同時(shí)以紅色價(jià)和色調(diào)為指標(biāo)對(duì)紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素進(jìn)行系統(tǒng)研究的相關(guān)報(bào)道。因此本文以紅色價(jià)和色調(diào)為指標(biāo)，對(duì)誘變得到的高產(chǎn)菌株紫紅曲霉M144液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，在提高紅曲紅色素產(chǎn)量的同時(shí)也加強(qiáng)了紅曲紅色素的視覺(jué)效果，使紅曲紅色素產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)一步提高。

1 材料與方法

1.1 菌種

紫紅曲霉M144：以紅曲霉CICC5017為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變獲得的紅曲紅色素高產(chǎn)菌株，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏[7]。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米粉5%，豆粕粉2%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 1.5%，pH 5.4，121℃滅菌20min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 1.5%，pH 5.4，121℃滅菌20min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將紫紅曲霉M144斜面菌種接入固體斜面培養(yǎng)基（PDA）中，30℃培養(yǎng)7d～10d。

1.3.2 紫紅曲霉M144種子液的制備

取1～2環(huán)紫紅曲霉M144斜面活化菌種接入液體種子培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h。

1.3.3 紫紅曲霉M144液態(tài)發(fā)酵

向裝有50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中接種10%（5mL）的紫紅曲霉M144種子液，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)6d，測(cè)定發(fā)酵液的紅色價(jià)及色調(diào)。

第一種方法是基于對(duì)象的行為數(shù)據(jù)的協(xié)同過(guò)濾算法(Collaborative Filtering,CF)。通過(guò)在對(duì)象的歷史行為(例如用戶的瀏覽記錄，購(gòu)買記錄等等)歸納出一種特定的模式，再通過(guò)這些行為記錄，利用一些基本的統(tǒng)計(jì)知識(shí)來(lái)分析這些用戶的歷史行為與產(chǎn)品的相似度。最后推薦將相似度最高且此用戶未瀏覽過(guò)的內(nèi)容推薦給用戶。這種算法可依據(jù)收集的用戶的歷史數(shù)據(jù)，來(lái)推薦世界上的任何一種東西。這個(gè)算法的實(shí)施步驟主要來(lái)說(shuō)可分為三個(gè)主要的階段：(1)收集、分析各個(gè)用戶的行為記錄。(2)尋找相近用戶。也就是找到和該用戶相似度最高的用戶。為了達(dá)到該目的，一般會(huì)使用調(diào)整余弦相似性來(lái)計(jì)算。

1.4 分析方法

紅曲紅色素色價(jià)的測(cè)定采用GS 15961-2005（食品添加劑紅曲紅色素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S]）[8]。

紅曲紅色素色調(diào)=OD505/OD420[9]。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析方法

以紅色價(jià)和色調(diào)為指標(biāo)，采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)[10]，篩選對(duì)紅色價(jià)和色調(diào)影響顯著的因子，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1；然后進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2；最后進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3；用SAS8.2進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要影響因素的確定

以液體深層發(fā)酵的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中各組份的含量為中心點(diǎn)，即玉米粉4.0%，豆粕粉2.0%，MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental design and results of factorial experiment

經(jīng)SAS軟件分析，玉米粉x1（p<0.01）、豆粕粉x2（p<0.01）的加量對(duì)紅色價(jià)影響顯著，MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O對(duì)紅色價(jià)的影響不顯著，因此把MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O固定在初始值即MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%。玉米粉x1（p<0.01）、MgSO4·7H2O x3（p<0.01）的加量對(duì)色調(diào)影響顯著，豆粕粉和K2HPO4·3H2O對(duì)色調(diào)的影響不顯著，因此把豆粕粉和K2HPO4·3H2O固定在初始值即豆粕粉為2.0%，K2HPO4·3H2O為0.1%。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明了Y1的主要影響因素為玉米粉和豆粕粉，Y2的主要影響因素為玉米粉和MgSO4·7H2O，根據(jù)此結(jié)果設(shè)計(jì)Y1和Y2的最陡爬坡路徑，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Y1和Y2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Y1and Y2in steepest accent experiment

從表2可以看出，第4組實(shí)驗(yàn)紅曲紅色素紅色價(jià)最高，說(shuō)明Y1的最優(yōu)點(diǎn)在第4組實(shí)驗(yàn)附近。第2組實(shí)驗(yàn)紅曲紅色素色價(jià)最高，說(shuō)明Y2的最優(yōu)點(diǎn)在第2組實(shí)驗(yàn)附近。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的最佳點(diǎn)為中心點(diǎn)分別對(duì)紅曲紅色素的紅色價(jià)（Y1）和色調(diào)（Y2）進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

對(duì)表3的分析結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸方程為：

圖1和圖2為計(jì)算得到響應(yīng)面圖可看出對(duì)紅色價(jià)和色調(diào)響應(yīng)的兩因素具有顯著的交互作用。

由SAS軟件進(jìn)行脊嶺分析，可知模型Y1的最大極值點(diǎn)為X1=4.69，X2=2.32，紅色價(jià)Y1=290.94U/mL，其他成分不變即MgSO4·7H2O 1.5%，K2HPO4·3H2O 0.1%。模型Y2的最大極值點(diǎn)為X11=4.40，X3=1.68，色調(diào)Y2=1.17，其他成分不變即豆粕粉2.0%，K2HPO4·3H2O 0.1%。

表3 Y1和Y2Box-Behnken 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Y1and Y2in Box-Behnken Central composite experiment

圖1 玉米粉和豆粕粉交互作用曲線圖Fig.1 Interaction diagram of corn power and bean power

圖2 玉米粉和MgSO4·7H2O交互作用曲線圖Fig.2 Interaction diagram of corn power and MgSO4·7H2O

把方程（1）和方程（2）聯(lián)合，經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析獲得最大預(yù)測(cè)紅色價(jià)與色調(diào)值為287.39U/mL和1.14，此時(shí)培養(yǎng)基組成為玉米粉4.52%，豆粕粉2.32%，MgSO4·7H2O 1.55%，K2HPO4·3H2O 0.1%。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以響應(yīng)面優(yōu)化獲得的最佳培養(yǎng)基和未優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4 Confirmatory experiment of response surface optimization

由表4可知，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中發(fā)酵后，平均紅色價(jià)為280.27 U/mL，比對(duì)照增加64.86%；平均色調(diào)為1.09，比對(duì)照色調(diào)值增加10.10%。

3 討論

目前對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素的研究中，在對(duì)紅色素發(fā)酵條件研究方面大都采用單因子實(shí)驗(yàn)或簡(jiǎn)單的正交實(shí)驗(yàn)，這種研究方法忽略了各因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，而且在研究中只以紅色素的色價(jià)為指標(biāo)，未考慮色價(jià)對(duì)紅色素質(zhì)量的影響[2-4，11-12]。

本文同時(shí)以紅色價(jià)和色調(diào)為指標(biāo)對(duì)紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素的培養(yǎng)基進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面優(yōu)化，利用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素培養(yǎng)基各成分進(jìn)行了評(píng)價(jià)，成功地篩選出影響紫紅曲霉M144發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素的關(guān)鍵培養(yǎng)基組分，省時(shí)省力，快速有效。在此基礎(chǔ)上通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化（RSM）建立了影響紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)，優(yōu)化了各因子水平，探討了各因子間的交互作用。

以誘變后的M144為出發(fā)菌株，在優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中紅曲紅色素的紅色價(jià)和色調(diào)分別為280.27U/mL和1.09，紅色價(jià)比山東荷澤學(xué)院王廣峰[11]研究的結(jié)果提高80.81%，色調(diào)沒(méi)有對(duì)照，是目前以玉米為原料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素的最高水平，與彭中健[12]以EW906為出發(fā)菌株，以大米為原料液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素的紅色價(jià)比高6.57%。同時(shí)大米的價(jià)格比玉米高40%，因此玉米是一種有優(yōu)勢(shì)的生產(chǎn)紅曲紅色素的原料。通過(guò)對(duì)紅色素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，有望進(jìn)一步提高以玉米為原料生產(chǎn)紅曲紅色素的紅色價(jià)和色調(diào)。

[1]田 莉，程劍峰.紅曲的生產(chǎn)及其應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2003（5）：24-27.

[2]李喜仙，劉 璽.小米液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素技術(shù)研究[J].食品添加劑，2002（9）：42-44.

[3]CARELSM,SHEPHERDD.Theeffect of pH and amino acid on condiation and pigment production ofMonaseus majorATCC 16362 andMonascus rubiginosusATCC 16367 in submerged shaken culture[J].Can J Microbiol,1998(24):1346-1357.

[4]CARELSM,SHEPHERD D.The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation inMonascusspecies in submerged shaken culture[J].Can J Microbiol,1997,23:1360-1372.

[5]夏書(shū)華，劉 穎.有關(guān)紅曲色素的提取及提高色價(jià)的研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14（1）：44-48.

[6]WONG HC,KOEHLER PE.Production of red water-soluble Monascus pigments[J].J Food Sci,1983(48):1200-1203.

[7]孫文紅，高玉榮.紫外誘變選育紅曲紅色素高產(chǎn)菌株的研究[J].釀酒，2008（1）：75-77.

[8]GS15961-2005，食品添加劑紅曲色素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S].

[9]沈士秀.紅曲的研究及應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2001，22（1）：85-87.

[10]劉振學(xué).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[11]王廣峰.紅曲色素液體深層發(fā)酵工藝研究[J].食品科技，2007，10（3）：90-95.

[12]彭中健，梁淑娃.液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的研究[J].四川食品與發(fā)酵，2004，28（4）：317-320.