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    HPLC測定生鮮乳中氨芐西林殘留方法的研究

    2012-04-13 02:29:28劉維華夏淑鴻高建龍武曉宏寧夏獸藥飼料監(jiān)察所
    中國乳業(yè) 2012年5期
    關(guān)鍵詞:氯乙酸氨芐西林青霉素

    文 / 劉維華 夏淑鴻 趙 娟 高建龍 武曉宏 寧夏獸藥飼料監(jiān)察所

    氨芐西林,又稱氨芐青霉素,是β-內(nèi)酰胺類青霉素的一種。氨芐西林屬于廣譜抗生素,對草綠色鏈球菌、白喉桿菌、破傷風(fēng)桿菌和放線菌的殺傷作用與青霉素相當,對腸球菌及李斯特菌的殺傷作用優(yōu)于青霉素,而對耐藥葡萄球菌及其它能產(chǎn)生青霉素酶的細菌無作用。氨芐西林對革蘭氏染色陰性細菌有效,但易產(chǎn)生耐藥性。

    氨芐西林的副作用主要表現(xiàn)為易使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng),且發(fā)生率較高,可達10%以上,多發(fā)生于用藥后5 天,癥狀以皮疹、蕁麻疹或斑丘疹為最常見,偶見過敏性休克。

    氨芐西林廣泛用于奶牛的巴氏桿菌病、肺炎、乳腺炎、子宮炎、腎盂腎炎、沙門氏菌腸炎的治療。如果養(yǎng)殖者對休藥期的規(guī)定執(zhí)行不嚴格,就增大了氨芐西林殘留于生鮮乳中的隱患。氨芐西林的分子式為(2S,5R,6R)-3,3-二甲基-6-[(R)-2-氨基-2苯乙酰胺基]-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-2-甲酸的三水化合物。NY/T 829—2004規(guī)定使用高效液相色譜檢測牛奶中氨芐青霉素的殘留。文本為了更好地應(yīng)用HPLC,指導(dǎo)實驗室工作,對其進行了方法學(xué)研究,現(xiàn)將試驗結(jié)果匯報如下。

    1 材料和方法

    1.1 主要儀器和試劑

    1.1.1 主要儀器

    Agilent 1100高效液相色譜儀(配FLD檢測器和ALS自動進樣器);高速冷凍離心機(HITACHI);WSZ-100-A振蕩器(上海安亭科學(xué)儀器廠);移液器(Fin npipette);水浴鍋。

    1.1.2 主要試劑

    氨芐西林對照品(C16H19N3O4S·3H2O):含量85.8%,批號K0210906,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;乙腈為色譜純;三氯乙酸、甲醛溶液、濃磷酸、磷酸氫二鉀均為分析純;去離子水。

    1.2 溶液制備

    1.2.1 標準溶液制備

    精密稱取氨芐西林對照品58.27 mg,置50 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻即得1000 μg/mL氨芐西林儲備液;精密量取儲備液100 μL,置50 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,即為2 μg/mL氨芐西林工作液。

    分別精密量取2 μg/mL氨芐西林工作液1.0、2.5 mL,置10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,得0.2、0.5 μg/mL氨芐西林標準陽性添加溶液。

    分別精密量取2 μg/mL氨芐西林工作液5、10、20、50、100、150、200、250 μL,置 10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,得1、2、4、10、20、30、40、50 μg/L氨芐西林標準系列溶液。

    1.2.2 陽性添加試料制備

    精密量取0.2、0.5 μg/mL氨芐西林工作液100 μL,置于4.90 mL離心后的空白生鮮乳中,使之成為4、10μg/L的陽性添加試料。

    1.2.3 其它試劑配制

    磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L):稱取2.7218 g磷酸二氫鉀置于1000 mL容量瓶中,加水900 mL,用54%磷酸調(diào)pH值至3.50±0.05,加水定容至刻度。

    三氯乙酸水溶液(20%):稱取10 g三氯乙酸至50 mL容量瓶中,加水定容,搖勻。

    三氯乙酸水溶液(75%):稱取35.5 g三氯乙酸置于50 mL容量瓶中,加水定容,搖勻。

    甲醛水溶液(7%):量取37%甲醛9.5 mL置于50 mL容量瓶中,加水定容,搖勻。乙腈水溶液(20%):量取10 mL乙腈至50 mL容量瓶中,加水定容,搖勻。

    1.3 試驗步驟

    取生鮮乳適量,以3500 rpm離心10 min除脂,精密量取5.00 mL下層溶液,置于塑料離心管中,加75%三氯乙酸水溶液0.50 mL,劇烈漩渦30 s。以6500 rpm離心10 min沉淀蛋白,精密量取上清液1.00 mL于10 mL螺口玻璃離心管中。

    在盛有1.00 mL上清液或標準工作液的螺口玻璃離心管中,加入20%三氯乙酸水溶液0.20 mL和7%甲醛水溶液0.20 mL,劇烈漩渦30 s。加蓋擰緊封口后,置沸水浴中衍生化30 min,取出,冷卻至室溫,加入20%乙腈水溶液0.60 mL,漩渦混勻10 s,經(jīng)0.45 μm親水性微孔濾膜過濾后作為待測溶液,用HPLC測定。同步作空白樣品和空白添加樣品的測定。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:ZORBAX SB-C18-C18,(4.6×250)m m;流動相:0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液-20%乙腈溶液(75%+25%);流速:1.0 mL/min;進樣量100μL;熒光檢測器激發(fā)波長346 nm,發(fā)射波長422 nm;進行多點校準,以色譜峰面積積分值定量。

    1.5 計算

    陽性添加試料回收率計算公式:R=K·(X- X0)/C×100%,公式中:

    X:試樣多點校準測定值(μg/L);

    X0:空白多點校準測定值(μg/L);

    C:陽性添加實際濃度(μg/L);

    K:稀釋倍數(shù)(5.00+0.50)/5.00=1.1。

    2 試驗結(jié)果

    2.1 標準曲線

    在上述色譜條件下,測定標準系列溶液吸收峰,氨芐西林的保留時間為6.1 min[色譜柱(4.6×250)mm,保留時間為9.7 min],回歸方程為:

    Y=68.11193 X+20.03117(R=0.99987)

    氨芐西林液相色譜具有良好的響應(yīng)值,理論板數(shù)為15200,峰面積與系列標準濃度呈良好的線性關(guān)系,線性范圍為1~50 μg/L。以3 倍信噪比計算求得儀器檢出限(LOD)為1 μg/L,以10 倍信噪比計算求得定量限(LOQ)為2 μg/L。

    2.2 加標回收率

    在空白試料中做4和10 μg/L 共2 個水平的陽性添加,每水平做5 份平行樣品,每份結(jié)果取平均值,考察3 批。氨芐西林的回收率、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)見表1、2。

    表1 氨芐西林4 μg/L添加樣品的結(jié)果

    表2 氨芐西林10 μg/L添加樣品結(jié)果

    2.3 不同系列濃度的氨芐西林溶液的穩(wěn)定性

    對不同系列濃度的氨芐西林溶液室溫(12~24 ℃)放置36 h,相同HPLC條件間隔測定,考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

    表3 不同濃度氨芐西林36 h色譜峰面積變化情況

    2.4 色譜柱的影響因素

    用Z O R B A X S B-C18,(4.6×250)m m和Z O R B A X SB-C18,(4.6×150)mm色譜柱,分別測定氨芐西林陽性添加各5 批,使用相同色譜條件,分別做標準曲線多點校準,測定相同陽性添加樣品,加標回收率有一定差異。結(jié)果見表4。

    表4 使用不同色譜柱的加標回收率測定結(jié)果比較

    3 分析討論

    3.1 生鮮乳樣品經(jīng)高速冷凍離心除脂,三氯乙酸溶液沉淀蛋白,得到較好的提取凈化。上清液中的氨芐西林與甲醛溶液在酸性條件下,加熱衍生化,生成2-羥基-3-苯基-6-甲基吡嗪(氨芐西林熒光衍生物)。該衍生物在熒光檢測器上具有較強的、特異性的響應(yīng)值,使用帶有熒光檢測器的高效液相色譜測定其吸收峰,激發(fā)波長346 nm,發(fā)射波長422 nm,與氨芐西林標準系列比較,測定殘留量。表明該方法可靠。

    3.2 由標準曲線得出,HPLC法測定生鮮乳中氨芐西林含量在1~50 μg/L范圍呈良好線性關(guān)系,回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.99987,色譜峰具有良好響應(yīng)值,峰周圍無基質(zhì)峰干擾,色譜峰理論板數(shù)為15200。以3 倍信噪比計算求得儀器檢出限(LOD)為1 μg/L,以10 倍信噪比計算求得定量限(LOQ)為2 μg/L。表明該方法可信。

    3.3 從加標回收試驗結(jié)果看,表1表明,氨芐西林4 μg/L陽性添加時,平均回收率為76.5%(n=15),回收率范圍為70.6%~85.8%,3 次考察批內(nèi)變異系數(shù)分別為4.8%、5.5%、5.9%,批間變異系數(shù)為2.4%。表2表明,10 μg/L陽性添加氨芐西林平均回收率為76.8%(n=15),回收率范圍為72.8%~83.9%,3 次考察批內(nèi)變系數(shù)為2.6%、2.1%、6.7%,批間變異系數(shù)為2.2%。2 個陽性添加樣品平均回收率差異不顯著,批間變異系數(shù)較低。表明穩(wěn)定性良好。

    3.4 使用相同色譜條件,待測液現(xiàn)配,分別室溫放置12、24、36 h。表3表明,液相色譜峰面積變化不顯著,說明批量處理樣品,在36 h內(nèi)完成檢測,對測定結(jié)果不會造成較大影響。表明測定重復(fù)性良好。

    3.5 使用(4.6×150)mm的色譜柱,保留時間為6.1 min,較(4.6×250)mm色譜柱保留時間提前了3 min,峰面積和峰高相應(yīng)增加,回收率提高2 個百分點,但使用(4.6×150)mm 色譜柱明顯有一拖尾基質(zhì)峰干擾。故選擇使用(4.6×250)mm色譜柱更可靠。

    3.6 值得提出的是,并非所有樣品都有空白值,空白試樣出現(xiàn)吸收峰時,添加經(jīng)衍生化的已知標準品進行峰面積疊加確證,空白試樣測定結(jié)果低于0.5 μg/L以下,可以忽略不計。進行氨芐西林殘留檢測時,盡量選擇無吸收峰的空白試樣。試樣除脂或沉淀蛋白不徹底,會影響衍生化,降低回收率,因此,檢測時劇烈漩渦是必要的。衍生化過程中,務(wù)必使用加蓋能密封的容器,以防止揮發(fā);終體積力求準確,使用刻度離心管定容務(wù)必校準后使用,建議定量加入為妥。

    3.7 本方法測定生鮮乳中的氨芐西林殘留,檢測條件穩(wěn)定,加標回收率較高,變異系數(shù)較小,重復(fù)性好,可操作性強,應(yīng)用簡單方便。對質(zhì)檢部門開展生鮮乳中獸藥殘留檢驗工作具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義。

    [1] NY/T 829—2004. 牛奶中氨芐青霉素殘留檢測方法-HPLC法.

    [2] 羅道栩,鄧國東,肖田安,等. 牛奶中氨芐青霉素殘留檢測方法研究. 中國獸藥雜志,2002,36(12):21-23.

    [3] 孟歡歡,陳玎玎,祁克宗. 高效毛細管電泳檢測牛奶中氨芐青霉素和阿莫西林殘留方法的建立.動物醫(yī)學(xué)進展,2008,29(1):32-25.

    [4] 付少剛,劉維華主編. 生鮮乳檢驗監(jiān)管指南. 銀川:陽光出版社,2010.

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