DNA-PKcs的研究進(jìn)展

蔡 昱綜述 翟建軍審校

DNA-蛋白激酶 (catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs)是DNA依賴蛋白酶 (DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)的催化亞單位，屬于PI3K家族，主要從事雙鏈DNA斷裂修復(fù)，在細(xì)胞的凋亡和防止腫瘤形成及腫瘤的耐藥、耐輻射中起著作用。我們對(duì)DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)功能、作用機(jī)制及在腫瘤中的作用作一探討?，F(xiàn)將其綜述如下。

1 DNA-PKcs的結(jié)構(gòu)及功能

DNA-PKcs也稱為DNA活化蛋白酶，是1個(gè)460～470 kD絲氨酸蘇氨酸酶，屬于1種腫瘤抑癌基因的看家基因[1]。DNA-PKcs作為1個(gè)具有催化活性的次單元體與1個(gè)具有結(jié)合DNA能力而調(diào)控其激活性的次單元體Ku共同組成DNA-PK[2]。DNA-PKcs同共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因(ataxia telangiectasia,mutated,ATM)和Rad3相關(guān)蛋白 (ATM-andRad3-related,ATR) 激酶均屬于PI3K家族[3]。最近幾年的研究，發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs主要從事雙股DNA斷裂(DNA Double -Strand Break;DSBs)的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)的修復(fù)和產(chǎn)生抗體多樣性V(D)J重組及復(fù)制調(diào)節(jié)。除此之外，DNA-PKcs在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核染色質(zhì)及端粒結(jié)構(gòu)的維持、T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞的發(fā)育中也具有相當(dāng)重要的作用。如果沒(méi)有基因重排,B細(xì)胞就不能成熟，因?yàn)锽細(xì)胞所攜帶的抗體是由V(D)J區(qū)的特定組合和連接過(guò)程中所附加的核酸所決定的[4～9]。

2 DNA-Pkcs作用機(jī)制

2.1 在NHEJ和V(D)J 重組中的作用

生物體本身基因的完整性容易受一些外在環(huán)境因素影響，輻射線的傷害或是一些化學(xué)試劑的破壞都會(huì)造成DNA的雙股鏈斷裂(double-strand break，DSBs)，DSBs也會(huì)在免疫球蛋白的位置特一性V(D)J 重組過(guò)程中產(chǎn)生。DNA的DSBs無(wú)法修補(bǔ)或是不正確的修補(bǔ)都將使染色體產(chǎn)生變異，從而導(dǎo)致細(xì)胞的癌變或是死亡。因此，對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)DSBs的修補(bǔ)與維持保有基因的完整性是非常重要的，其中最主要的修補(bǔ)機(jī)制就是NHEJ。這種修復(fù)機(jī)制的特性是2個(gè)重組DNA分子并不需要互補(bǔ)的DNA序列。NHEJ的修補(bǔ)成員有DNA-PKcs、Ku、DNA連接酶(DNA-ligase)Ⅳ和XRCC4 蛋白等，其中以DNA-PKcs為主要作用。NHEJ在免疫細(xì)胞的分化和發(fā)育上，在抗體多樣性的V(D)J 重組作用方面亦扮演尤為重要的角色。NHEJ經(jīng)由V(D)J 重組可產(chǎn)生多樣性的抗體和T細(xì)胞接受子以認(rèn)識(shí)及對(duì)抗外來(lái)的抗原[9～11]。

所謂的V(D)J 重組是由任一V (Variable)基因片段和任一的D (Diversity) 或J (Joining)基因的片段隨意連接在一起以解釋成可認(rèn)識(shí)抗原的功能區(qū)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，V(D)J 重組作用可分成2個(gè)階段，第一、2個(gè)淋巴細(xì)胞特有的蛋白質(zhì)，RAG1 和RAG2 (重組活化基因)認(rèn)識(shí)RSS (重組信號(hào)序列)于V ，D 和J 基因兩側(cè)，進(jìn)行雙股DNA斷裂(DSB)，產(chǎn)生開(kāi)始信號(hào)端(Signal ends)和發(fā)夾狀帶碼端(Hairpined coding ends)。第二、經(jīng)由NHEJ 的作用，開(kāi)始信號(hào)端和發(fā)夾狀帶碼端分別連接在一起。目前已知參與連接的蛋白質(zhì)和NHEJ 的DNA DSB 修復(fù)為相同的蛋白質(zhì)，有4個(gè)重要的互補(bǔ)分布群組在NHEJ 中扮演重要的角色，分別是XRCC4,XRCC5,XRCC6 及 XRCC7 。XRCC4與DNA 連接酶Ⅳ共存在同一多蛋白質(zhì)復(fù)合體中，XRCC4 可以增加DNA連接酶Ⅳ的活性。而XRCC5,XRCC6 及XRCC7 則分別代表Ku80,Ku70及DNA-PKcs的基因。因此，DNA-PK在NHEJ中也扮演著尤為重要的角色[12，13]。

2.2 調(diào)控機(jī)制

2.2.1 Ku對(duì)DNA-PKcs的調(diào)控作用 Ku蛋白是DNA結(jié)合蛋白，是Ku70/Ku80異源二聚體，這個(gè)復(fù)合體能補(bǔ)充、活化DNA依賴激酶催化亞單位(DNA-PKcs)共同組成DNA依賴激酶(DNA-PK) 。Ku是1個(gè)功能保守的端粒蛋白，它從啤酒酵母到人都十分保守，緊密結(jié)合于雙鏈DNA的突出端或平末端。Ku同DNA-PKcs一起，參與由非同源末端融合導(dǎo)致的DNA鏈斷裂和V(D)J重組中DNA鏈的修復(fù)，也可能通過(guò)進(jìn)化保守機(jī)制同時(shí)參與端粒的復(fù)制和染色體的末端保護(hù)。一般認(rèn)為DNA-PK的活化模式是透過(guò)Ku 的作用。Ku 可以結(jié)合到受損雙股DNA 的斷裂處，似乎Ku可以辨認(rèn)DNA的DSBs，結(jié)合在DNA的Ku 經(jīng)由其立體結(jié)構(gòu)的變異，促使DNA-PKcs 在DNA/Ku 的復(fù)合體上組合，以形成1個(gè)具有反應(yīng)活性的多蛋白質(zhì)復(fù)合體 DNA/Ku/DNA-PKcs 。此反應(yīng)復(fù)合體可以促使 NHEJ 成員的組合或是會(huì)影響到一些參與NHEJ 因子的活性。此種方式，一方面可以防止受損DNA 的末端繼續(xù)受到其他核酸酶的作用，另一方面Ku/ DNA-PKcs 可以增加DNA 連接酶的活性，促使受損DNA 的末端相互連接。這證明Ku蛋白和DNA-PKcs在維持人體正常免疫功能，調(diào)節(jié)DNA修復(fù)，防止細(xì)胞惡變方面有很重要的作用[9，14]。

2.2.2 其他因素對(duì)DNA -PKcs磷酸化的調(diào)控 DNA-PK 在DSB 的修補(bǔ)與V(D)J 的重組中是扮演著重要的角色，而DNA-PK的活性也會(huì)受到DNA-PKcs磷酸化的調(diào)控。DNA-PKcs 的自我磷酸化會(huì)使其與Ku 分開(kāi)而抑制 DNA-PK 的催化活性；另外就是依賴白血病病毒(c-Abl)對(duì)DNA-PK 的調(diào)控模式，活化的c-Abl 會(huì)使DNA-PKcs 磷酸化，促使DNA-PKcs/Ku 復(fù)合體的分開(kāi)而抑制 DNA-PK 的催化活性。此外，在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，DNA-PKcs 會(huì)被Caspase-3 所分解而喪失激酶活性；PKC δ 也會(huì)抑制DNA-PK 的激酶活性[15，16]。

2.3 DNA-Pkcs與端粒的關(guān)系

端粒，線性染色體的自然末端，包含非編碼的富鳥(niǎo)苷酸的重復(fù)序列，并終止于1個(gè)富鳥(niǎo)苷酸單鏈突出端。它的2個(gè)特征—序列和結(jié)構(gòu)—提供了1個(gè)末端處蛋白作用的平臺(tái)，從而形成了1個(gè)保護(hù)性的“帽”，使得端粒免于象別的DNA雙鏈一樣斷裂，如降解或非同源重組；且在維持遺傳的穩(wěn)定性和阻止癌變中也起著重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在端粒的帽子形成、維持端粒長(zhǎng)度及穩(wěn)定性中起著作用。端粒酶缺陷的人體細(xì)胞中DNA-PKcs的丟失可加速端粒的降解及細(xì)胞凋亡，或染色體不穩(wěn)定性增加，最終導(dǎo)致癌癥。可見(jiàn)DNA-PKcs在癌癥和老化中起著關(guān)鍵作用[9，10]。

3 DNA-PKcs在腫瘤中的作用

機(jī)體受內(nèi)外環(huán)境因素的影響，發(fā)生不同類型的DNA損傷,但是機(jī)體具有多種修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)損傷,恢復(fù)DNA結(jié)構(gòu)和功能。如果DNA-PKcs(機(jī)體最主要的修復(fù)系統(tǒng)組成部分DNA-PK的核心成員)丟失DNA修復(fù)缺陷,表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性，就會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控基因等的失活,從而促使細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[5]。

從癌變細(xì)胞的細(xì)胞核型分析結(jié)果可以看出,癌變細(xì)胞普遍存在染色體缺失現(xiàn)象,惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA斷裂修復(fù)能力明顯降低。通過(guò)基因芯片,分子雜交等分析,發(fā)現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化早期階段部分DNA修復(fù)基因的表達(dá)發(fā)生明顯改變,如XRCC-2,XRCC-3和Ku80(XRCC-5)的mRNA表達(dá)下調(diào),但發(fā)現(xiàn)其中屬于PI3K激酶家族成員的修復(fù)基因DNA-PKcs在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化早期階段受到抑制,惡性轉(zhuǎn)化后表達(dá)又上升[1，17，18]。

目前有人用免疫組化法檢測(cè)肝膽腫瘤組織和部分癌旁組織中催化亞基DNA-PKcs蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs表達(dá)在不同類型腫瘤間存在明顯差異。肝細(xì)胞癌、膽管腺癌和膽囊腺癌的DNA-PKcs陽(yáng)性表達(dá)率依次降低，而乳頭狀腺瘤或膽管腺瘤則不表達(dá)或弱表達(dá)。侵襲性腺瘤(癌)組織表達(dá)水平顯著高于非侵襲性腺瘤(癌)。癌旁組織相對(duì)低表達(dá)DNA-PKcs。表明DNA-PKcs表達(dá)水平與腫瘤類型、惡性程度、轉(zhuǎn)移或侵襲性有關(guān)，有可能成為肝膽腫瘤的1個(gè)新的生物標(biāo)志物[19]。但是有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮中DNA-PKcs看家基因受一些因素破壞，容易發(fā)生結(jié)腸癌[20]；還發(fā)現(xiàn)SCID小鼠易患T細(xì)胞淋巴瘤[2]，且胸腺細(xì)胞受電離輻射激活p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但并不能阻斷細(xì)胞周期[21]；因此對(duì)于DNA-PKcs是致癌還是抑癌作用尚待進(jìn)一步研究。

許多動(dòng)物及細(xì)胞的模式實(shí)驗(yàn)，已顯示出SCID(Severe combined immunodeficiency)小鼠有DNA-PKcs 基因的突變，造成其對(duì)輻射線的高度敏感性與V(D) J 重組的嚴(yán)重缺陷[4，22]。SCID小鼠非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中DNA-PKcs的高表達(dá)致使DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)活性增高，這是NSCLC放療抗拒性的重要原因[23]，可能由于正常情況下DNA-PK基因修復(fù)受損的基因，癌細(xì)胞也利用DNA-PK基因來(lái)修復(fù)由抗癌治療引起的損傷，使得腫瘤對(duì)治療產(chǎn)生抵抗。

總之，DNA-PKcs作為人體修復(fù)系統(tǒng)的重要組成部分DNA-PK的核心成員，主要從事DSBs的修復(fù)，在端粒及染色體結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤方面有著重要的作用。

[1]Masako O，Tsuneyuki U，Toshihiko K,et al.High susceptibility of Sc-id mice to colon carcinogenesis induced by azoxymethane indicates a possible caretaker role for DNA-dependent protein kinase〔J〕.Carcinogenesis,2001,22(9): 1551.

[2]Katsuya Inagaki,Congrong Ma,Theresa A Storm,et al.The role of DNA-PKcs and artemis in opening viral DNA hairpin termini in various tissues in mice〔J〕.Journal of Virology,2007,81(20): 11304.

[3]Rivera-Calzada A,Maman JD,Spagnolo L，et al.Three-dimensional structure and regulation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs)〔J〕. Structure,2005，13(2)：243.

[4]Spagnolo L,Rivera CA,Pearl LH，et al.Three-dimensional structure of the human DNA-PKcs/Ku70/Ku80 complex assembled on DNA and its implications for DNA DSB repair〔J〕.Molecular Cell,2006，19(22):511.

[5]Cook AJ,Oganesian L,Harumal P,et al.Reduced switching in SCID B cells is associated with altered somatic mutation of recombined S regions〔J〕.J Immunol,2003,171(12):6556.

[6]Richard S Maser，Kwok-Kin Wong，Erguen Sahin， et al.DNA-dependent protein kinase catalytic subunit is not required for dysfunctional telomere fusion and checkpoint response in the telomerase-deficient mouse〔J〕.Molecular and Cellular Biology,2007,27(6):2253.

[7]Mingan Shi Carolyn J Vivian,Kyung-Jong Lee,et al.DNA-PKcs-PIDdosome:a nuclear caspase-2-activating complex with role in G2/M checkpoint maintenance〔J〕.Cell,2009,136(3)508.

[8]Mirjam van der Burg,Hanna IJspeert,Nicole S Verkaik,et al.A DNA-PKcs mutation in a radiosensitive T-B- SCID patient inhibits Artemis activation and nonhomologous end-joining〔J〕.Journal of Clinical Investigation,2009,119 (1):91.

[9]Wang H,Perrault AR,Takeda Y,et al.Biochemical evidence for Ku-independent backup pathways of NHEJ〔J〕.Nucleic Acids Res,2003,31(18):5377.

[10]Jacob Falck,Julia Coates,Stephen P Jackson.Conserved modes of recruitment of ATM,ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage〔J〕.Nature,2005,434(7033):605.

[11]Rooney S,Sekiguchi J,Zhu C,et al.Leaky scid phenotype associated with defective V(D)J coding end procession in Artemis -deficient mice〔J〕.Mol Cell,2002,10(6):1379.

[12]van Gent DC,Ramsden DA,Gellert M.The RAG1 and RAG2 proteins establish the 12/23 rule in V(D)J recombination〔J〕.Cell,1996,85:107.

[13]Jorge MS,Patricia C.VDJ recombination:artemis and its in vivo role in hairpin opening〔J〕.The Journal of Experimental Medicine,2003，197(5):543.

[14]蔡 云,羅慶豐,高 玟,等.KU80蛋白在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的臨床意義〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2010，25(6)：599.

[15]Jin S,Kharbanda S,Mayer B,et al.Binding of Ku and c-Abl at the kinase homology region of DNA-dependent protein kinase catalytic subunit〔J〕.J Biol Chem,1997,272(40):24763.

[16]Morrison C,Smith GC,Stingl L,et al.Genetic interaction between PARP and DNA-PK in V(D)J recombination and tumorigenesis〔J〕.Nat Genet,1997,17 (4): 479.

[17]Mandal M,Adam L,Kumar R,et al.Redistribution of activated cas-pase-3 to the nucleus during butyric acid-induced apoptosis〔J〕.Biochem Bio Res Commun,1999,260(3):775.

[18]Sun JF ,Sui JL,Zhou PK,et al.Decreased efficiency of γ-ray-induced DNA double-strand break rejoining in malignant transformants of human bronchial epithelial cells generated by alpha-particle exposure〔J〕.International Journal of Radiation Biology,2002,78 (9):773.

[19]余子建 ,隋建麗,丁映欽,等.肝膽腫瘤組織中DNA依賴蛋白激酶的表達(dá)及意義〔J〕.中華肝臟病雜志，2004，12(11)：652.

[20]Ochiai M,Ubagai T,Kawamori T，et al.High susceptibility of Scid mice to colon carcinogenesis induced by azoxymethane indicates a possible caretaker role for DNA-dependent protein kinase〔J〕.Arcinogenesis,2001,22(9):1551.

[21]Wang S.The catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase selectively regulates p53-dependent apoptosis but not cell-cycle arrest〔J〕.Proc Natl Acad Sci,2000,97(4):1584.

[22]Sak A,Stuschke M,Wurm R,et al.Selective inactivation of DNA-dependent protein kinase with antisense oligodeoxynucleotides: consequences for the rejoining of radiation-induced DNA double-strand breaks and radiosensitivity of human cancer cell lines〔J〕.Cancer Res,2002,62(22):6621.

[23]Sang-wook LEE M D,Kyung-ja CHO M D,Jin-hong PARK M D,et al.Expressions of ku70 and dna-pkcs as prognostic indicators of local control in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.International Journal of Radiation Oncology-Biology-Physics,2005,62(5):1451.