耐阿德福韋酯乙型肝炎病毒感染與處理研究進(jìn)展*

方立慶 綜述 張振華 李旭 審校

HBV感染嚴(yán)重危及人類的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)全球范圍內(nèi)大約有3.5億HBV慢性感染者[1]，其預(yù)后不良，易反復(fù)發(fā)作，可發(fā)展為肝硬化和原發(fā)性肝癌。核苷（酸）類藥物問世已有11年，在這段時(shí)間內(nèi)，大大提升了對(duì)慢性乙型肝炎（CHB）患者的臨床管理。但抗HBV藥物的耐藥已成為制約乙肝抗病毒治療的最重要問題之一。阿德福韋酯（ADV）是嘌呤類核苷類似物，2002年獲得美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，2005年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)在我國(guó)應(yīng)用于臨床。ADV能有效抑制病毒的復(fù)制，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)其耐藥的變異株被選擇出來，且漸成為優(yōu)勢(shì)毒株。本文就ADV抗HBV治療的耐藥現(xiàn)狀及耐藥突變的基礎(chǔ)、ADV耐藥的檢測(cè)及預(yù)防方法、ADV耐藥后的挽救治療策略等方面做簡(jiǎn)要綜述。

一、ADV抗HBV的耐藥現(xiàn)狀及其耐藥突變的基礎(chǔ)

（一）耐藥現(xiàn)狀 ADV耐藥率較低，ADV治療1～5年的累積耐藥相關(guān)變異發(fā)生率分別為0%、3%、11%、18%、29%，因耐藥出現(xiàn)病毒學(xué)與生化學(xué)突破的概率在1～5年時(shí)分別為0%、2%、6%、10%、11%、l2%[2]。長(zhǎng)期使用ADV的患者可發(fā)生rtA181V/T和（或）rtN236T變異，導(dǎo)致對(duì)ADV耐藥[3]。這是目前已證實(shí)的與阿德福韋耐藥相關(guān)的主要變異。其他變異還有 rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S等。原發(fā)性 ADV耐藥（rtA181T、rtI233V）也有報(bào)道[4]。Schildgen等[5]報(bào)道了3例慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)罕見的HBV聚合酶RT區(qū)變異rtI233V。對(duì)拉米夫定（LAM）耐藥患者，加用或換用ADV，出現(xiàn)ADV耐藥的發(fā)生率顯著高于ADV初治患者[6]。ADV治療包括LAM耐藥病例在內(nèi)的CHB患者，1年耐藥發(fā)生率升高至5%，2年發(fā)生率為20%[7]。

邵幼林[8]等對(duì)28例初始LAM治療的CHB患者，其中男25 例，女 3 例，年齡 18～60（平均 36.67±10.54）歲，出現(xiàn) LAM耐藥后換用ADV單藥序貫治療，發(fā)生ADV再耐藥患者HBV變異株動(dòng)態(tài)變化存在5種形式：（1）隨HBV DNA逐漸下降，LAM耐藥株比例減少并發(fā)生完全病毒學(xué)應(yīng)答：隨療程的延長(zhǎng)，HBV DNA突破，ADV耐藥變異出現(xiàn)（8例）；（2）換用ADV治療后不充分病毒學(xué)應(yīng)答，在LAM耐藥株的基礎(chǔ)上出現(xiàn)ADV耐藥變異，即對(duì)LAM和ADV的多重耐藥變異株（3例）；（3）換用ADV治療后不充分病毒學(xué)應(yīng)答，LAM耐藥株依然存在（10例）；（4）換用ADV治療后不充分病毒學(xué)應(yīng)答，LAM耐藥株消失后成為野毒株（4例）；（5）LAM和ADV治療過程中病毒學(xué)均不充分應(yīng)答，但無(wú)耐藥變異（3例）。

（二）耐藥產(chǎn)生基礎(chǔ) HBV聚合酶缺乏3’-5’外切酶校對(duì)功能，錯(cuò)配發(fā)生率較高，因此HBV比其他DNA病毒更容易發(fā)生變異。在HBV慢性感染者體內(nèi)存在不同準(zhǔn)種（quasi-specie）[9]，一個(gè)準(zhǔn)種即一個(gè)突變株，所以HBV在復(fù)制過程中具有較高的自然變異率，并且每24h就可產(chǎn)生3.2×1010含有單一位點(diǎn)突變的HBV DNA[10]。如果HBV基因突變恰好位于HBV DNA聚合酶（P）的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域，就有可能產(chǎn)生耐藥。

另外，HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）是HBV基因組復(fù)制中間體mRNA和前基因組RNA的合成模板，是HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵[11]。cccDNA不僅是轉(zhuǎn)錄各種病毒RNA模板，同時(shí)也是HBV病毒前基因組RNA的復(fù)制模板，編碼多功能聚合酶、核心蛋白質(zhì)及X和S蛋白[12]。目前尚無(wú)特效藥物作用于cccDNA，且一些變異株也可能以cccDNA形式存在，這使得耐藥菌株可持續(xù)存在。所以，HBV DNA的復(fù)制率高、突變率高和cccDNA難以清除是HBV容易出現(xiàn)耐藥的主要因素。

由于HBV本身的復(fù)制特點(diǎn)，對(duì)抗病毒藥物耐藥是不可避免的。與耐藥有關(guān)的因素除了上述的病毒因素外還主要包括宿主因素和藥物因素。宿主因素：治療前患者的HBV DNA水平、抗病毒治療不規(guī)則以及抗病毒藥物選擇不合理、患者的依從性差等。藥物因素：藥物的空間結(jié)構(gòu)、基因屏障和藥代動(dòng)力學(xué)屏障等。ADV與自然底物脫氧胞苷三磷酸（dCTP）存在微小差異，而LAM與dCTP存在顯著差異因此ADV耐藥發(fā)生率明顯低于LAM。

ADV和HBV野生型毒株作用時(shí)，與HBV-RT區(qū)有兩個(gè)氫鍵緊密結(jié)合：一個(gè)位于RT區(qū)236位天冬氨酸的末端氫原子和ADV的末端磷酸根的氧原子之間，另外一個(gè)位于236位天冬氨酸的羰基和85位絲氨酸的羥基之間。當(dāng)發(fā)生rtN236T變異時(shí)，這兩個(gè)氫鍵會(huì)丟失，同時(shí)伴隨著靜電相互作用的顯著減少，而此時(shí)脫氧三磷酸腺苷（dNTP）與DNA聚合酶的親和力下降卻不明顯，HBV DNA仍可繼續(xù)大量合成[13]。

目前耐藥病毒因素的研究已取得一定的成效，宿主因素、基因屏障和藥代動(dòng)力學(xué)屏障目前研究處于初級(jí)階段，HBV對(duì)阿德福韋耐藥的分子基礎(chǔ)研究甚少，均有待進(jìn)一步研究深入。

二、ADV耐藥的檢測(cè)及預(yù)防方法

（一）ADV耐藥的檢測(cè)方法盡管有多種方法[14]（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法、DNA芯片法、焦磷酸測(cè)序法、克隆測(cè)序法、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定法等）可以用來監(jiān)測(cè)ADV耐藥突變，但臨床上應(yīng)用最多的還是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法（direct or population sequencing）和反向線性雜交法（INNO LiPA）[15]。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法提供的信息量豐富，可檢測(cè)已知與未知的突變，缺點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度較低，常需要血清HBV DNA＞104copies/ml，病毒突變株的比例達(dá)20%～25%。INNO LiPA的檢測(cè)靈敏度高，最低能夠檢測(cè)到5%的突變株，但只能檢測(cè)到已知的突變，且現(xiàn)階段分辨同一突變位點(diǎn)（如rt184位點(diǎn)）多種突變形式的能力有限[16]?？傊?，設(shè)計(jì)靈敏、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的耐藥檢測(cè)方法是今后HBV耐藥檢測(cè)的一個(gè)重要課題。

（二）ADV耐藥的預(yù)防方法 有研究證實(shí)ADV治療LAM耐藥患者時(shí)ADV的耐藥發(fā)生率要比ADV治療初治患者時(shí)高，且療程不足會(huì)導(dǎo)致肝炎復(fù)發(fā)。Ayoub WS等[17]指出需要長(zhǎng)期治療的患者單用或聯(lián)合治療核苷（酸）類藥物都能有效地防止耐藥性的發(fā)生發(fā)展。單用治療：有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)AM耐藥的產(chǎn)生讓患者在后續(xù)抗病毒治療中面臨更大的耐藥風(fēng)險(xiǎn)，因此在核苷初治患者啟動(dòng)抗病毒治療時(shí)，可以選擇耐藥基因屏障較高（同時(shí)發(fā)生3個(gè)或3個(gè)以上位點(diǎn)變異才導(dǎo)致耐藥）、抗病毒效應(yīng)較強(qiáng)的藥物，如恩替卡韋或替諾福韋來預(yù)防耐藥的產(chǎn)生[18]。聯(lián)合治療：最近Lampertieo P等[19]應(yīng)用ADV聯(lián)合LAM治療145例LAM耐藥的CHB患者3年，其中有116例（約80%）出現(xiàn)HBV DNA清除，145例均無(wú)臨床學(xué)和病毒學(xué)的突破。無(wú)論HBV DNA的抑制程度如何，rtA181v/T是惟一檢出的與ADV耐藥相關(guān)的變異，在基線時(shí)6例（1 rtA181V和5 rtA181T），治療期間增加3例（為rtA181T）。此9例患者中7例在治療期間HBV DNA下降不明顯。rtA181T變異4年累計(jì)發(fā)生率為4%。由此可知ADV與LAM聯(lián)合治療可降低HBV對(duì)ADV耐藥性。國(guó)內(nèi)周淑云等[20]觀察152例ADV治療LAM耐藥CHB患者療效以及ADV的耐藥情況，也證明了此項(xiàng)結(jié)果。

此外，選擇合適的時(shí)機(jī)進(jìn)行抗病毒治療、提高患者依從性、早期應(yīng)答不理想及時(shí)換藥等也有助于預(yù)防耐藥的發(fā)生。ADV可在治療48周時(shí)進(jìn)行療效評(píng)估。如果患者血清HBV DNA未達(dá)到檢測(cè)值下限，則在此時(shí)調(diào)整治療方案以降低后期耐藥的發(fā)生率。

三、ADV耐藥后的挽救治療策略

（一）藥物替代療法 在ADV發(fā)生耐藥后，可選擇和ADV耐藥位點(diǎn)不重疊而且無(wú)交叉耐藥的藥物治療。出現(xiàn)rtN236T耐藥可選擇拉米夫定（LAM）、恩替卡韋（ETV）或替比夫定，而對(duì)rtA181V突變的菌株LAM、ETV的敏感性有所下降，對(duì)替諾福韋敏感性較高。替諾福韋對(duì)ADV耐藥者有較好療效，無(wú)論是發(fā)生rtA181 V、rtN236T單一突變還是聯(lián)合突變，均對(duì)替諾福韋敏感[21]。Laoi BN等[22]使用恩替卡韋成功治療了2例ADV耐藥（分別是rtAl81V和rtAl81T變異）的患者。Schildgen O等[23]使用替諾福韋治療對(duì)ADV原發(fā)性耐藥（rtI233V）的3例患者，均取得滿意的效果。

（二）聯(lián)合用藥 ADV耐藥后聯(lián)合用藥的臨床資料報(bào)告鮮見。目前推薦，對(duì)于發(fā)生ADV耐藥的患者，在臨床上可加用LAM，可能優(yōu)于換成LAM單藥治療。各種抗HBV核苷類似藥物陸續(xù)出現(xiàn)，在一定意義上為聯(lián)合治療提供了條件。聯(lián)合治療能夠增強(qiáng)抗病毒能力和減低耐藥的發(fā)生率。對(duì)于LAM耐藥的患者采用LAM+ADV聯(lián)合治療，產(chǎn)生ADV耐藥的概率小于單獨(dú)用ADV[24]。但在抗HBV聯(lián)合用藥治療的研究方面還不夠充分[7]。有研究指出，干擾素聯(lián)合ADV使用既克服了單用干擾素對(duì)高載量病毒、高ALT水平療效欠佳的缺點(diǎn)，同時(shí)也避免了單用ADV容易耐藥及不能夠突然停藥的特點(diǎn)[25]。也有ADV聯(lián)合胸腺肽以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥（甘草酸二胺腸溶液、苦參素等）治療相關(guān)報(bào)道。聯(lián)合治療可能是未來抗病毒研究的新熱點(diǎn)。

（三）免疫調(diào)節(jié)治療 HBV感染后可引起人體對(duì)HBV的免疫耐受（產(chǎn)生無(wú)或低免疫應(yīng)答），體內(nèi)的HBV不能清除，使得病毒在體內(nèi)的持續(xù)存在和復(fù)制。免疫調(diào)節(jié)治療的目的就是打破免疫耐受，恢復(fù)病毒特異性T細(xì)胞的應(yīng)答。目前CHB免疫治療多為非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，包括胸腺肽、胸腺肽a1、微卡（母牛分枝桿菌制劑）、左旋咪唑搽劑等。特異性免疫調(diào)節(jié)劑包括各種治療性疫苗，如特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞多肽疫苗、S和前S2蛋白疫苗、HBsAg/抗-HBs免疫復(fù)合物疫苗、HBV特異性核酸疫苗等[26]。免疫調(diào)節(jié)治療相關(guān)的研究還不夠充分，臨床尚未有統(tǒng)一意見，能否成為抗HBV治療的主力還有待研究。

四、小結(jié)

長(zhǎng)期抗病毒治療導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，是目前抗病毒治療的一大難題。必須高度重視預(yù)防HBV多重耐藥毒株的出現(xiàn)，應(yīng)盡快建立研究HBV耐藥的一系列技術(shù)平臺(tái)。耐藥的檢測(cè)、預(yù)防顯得尤為重要，但目前還不能確定哪一種方法是檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，將來需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)研究。另外，基因表型分析能幫助臨床工作者選擇最優(yōu)的治療方案，有利于預(yù)防和減少耐藥率。聯(lián)合治療可能是將來治療慢性乙型肝炎的重要趨勢(shì)。目前，對(duì)聯(lián)合治療的評(píng)估研究仍處于初級(jí)階段，新的、更安全的、更有效的聯(lián)合治療方案還有待進(jìn)一步臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

[1]Yogeswaran K，F(xiàn)ung SK.Chronic hepatitis B in pregnancy:unique challenges and opportunities.Korean J Hepatol，2011，17（1）:1-8.

[2]Pawlotsky JM，Dusheiko G，Hatzakis A，et a1.Virologic monitoring of hepatitis B virus therapy in clinical trials and practice:recommendations for a standardized approach.Gastroenterology，2008，134（2）:405-415.

[3]Pallier C，Rodriguez C，Brillet R，et a1.Complex dynamics of hepatitis B virus resistance to adefovir.Hepatology，2009，49（1）:50-59.

[4]Yamahan T，Sertioz R，Pullukcu H，et a1.A case of chronic hepatitis B with primary adefovir resistance.Mikrobiyol Bul，2007，41（2）:297-301.

[5]Schildgen O，Sirma H，F(xiàn)unk A，et a1.Variant of hepatitis B virus with primary resistance to adefovir.N Engl J Med，2006，354（17）:l807-l8l2.

[6]Yeon JE，Yoo W，Hong SP，et a1.Resistance to adefovir dipivoxilin lamivudine resistantchronic hepatitisB patients treated with adefovir dipivoxil.Gut，2006，55（10）:1488-1495.

[7]Fung SK，Chae HB，F(xiàn)ontana RJ，et a1.Virologic response and resistance to adefovir in patients with chronic hepatitis B.Hepatology，2006，44（2）:283-290.

[8]邵幼林，陳良云，吳金華.LAM耐藥后ADV序貫治療再耐藥HBV變異株的動(dòng)態(tài)變化.世界華人消化雜志，2010，18（18）：1895-1901.

[9]Cui XJ，Cho YK，Song HI，et a1.Molecular characteristics and functional analysis of full-length hepatitis B virus quasispecies from a Patient with chronic hepatitis B virus infection.Virus Res，2010，150（1-2）:43-48.

[10]蔣自衛(wèi)，史文高.乙型肝炎病毒基因變異和耐藥與臨床肝病的關(guān)系. 臨床肝膽病雜志，2010，26（4）：438-440，445.

[11]Takkenberg RB，Zaaijer HL，Molenkamp R，et a1.Validation of asensitiveand specificreal-time PCR fordetection and quantitation ofhepatitisB viruscovalently closed circular DNA in plasma of chronic hepatitis B patients.J Med Virol，2009，81（6）:988-995.

[12]Kock J，Baumert TF，Delaney WE，et a1.Inhibitory effect of adfovir and lamivudine on the initiation of hepatitis B virus infection in primary tupaia hepatocytes.Hepatology，2003，38（6）:1410-1418.

[13]Yadav V，Chu CK.Molecular mechanisms of adefovir sensitivity and resistance in HBV polymerase mutants:a molecular dynamics study.Bioorg Med Chem Lett，2004，14（16）:4313-4317.

[14]徐東平.乙型肝炎病毒耐藥的檢測(cè)方法與臨床意義.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，35（6）：611-613.

[15]Lok AS，Zoulim F，Locarnini S，et a1.Antiviral drug resistant HBV:standardization of nomenclature and assays and recommendations for management.Hepatology，2007，46（1）:254-265.

[16]Degertekin B，Hussain M，Tan J，et al.Sensitivity and accuracy of an updated line probe assay（HBV DR v.3） in detecting mutations associated with hepatitis B antiviral resistance.Hepatology，2009，50（1）:42-48.

[17]Ayoub WS，Keeffe eb.Review article:current antiviral therapy of chronic hepatitis B.Aliment Pharmacol Ther，2008，28（2）:167-177.

[18]吳超飛，秦勁鋒，周彬，等.阿德福韋酯單藥及其聯(lián)合拉米夫定治療拉米夫定耐藥型HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的療效比較.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10（4）：423-425.

[19]Lampertico P，Vigano M，Manenti E，et a1.Low resistance to adefovircombined with lamivudine:a 3-yearstudy of145 lamivudine resistant hepatitis B patients.Gastroenterology，2007，133（12）:1445-1451.

[20]周淑云，張亞杰.阿德福韋酯對(duì)拉米夫定耐藥的慢性乙型肝炎患者的療效觀察. 臨床肝膽病雜志，2010，26（2）：178-179，186.

[21]Delaney WE，Ray AS，Yang H，et a1.Intracellular metabolism and in vitro activity of tenofovir against hepatitis B virus.Antimi Agents Chemother，2006，50（7）:2471-2477.

[22]Laoi BN，Herra C，Norris S，et al.First report of genotypic resistance to adefovir in chronic HBV in the Republic of Ireland.J Antimicrob Chemother，2006，57（5）:l009-10l0.

[23]Schildgen O，Sirma H，F(xiàn)unk A，et a1.Variant of hepatitis B viruswith primaryresistanceto adefovir.N EnglJMed.2006，354（17）:l807-l8l2.

[24]Yuen MF，Lai CL.Treatment of chronic hepatitis B:Evolution over two decades.Gastroenterol Hepatol，2011，26 （Suppl 1）:138-143.

[25]羅先平，經(jīng)繼生，陳紅波，等.干擾素聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎 2 年隨訪. 肝臟，2010，15（3）：233-234.

[26]胡瑩，馬福寶.乙型肝炎病毒感染者免疫治療的研究進(jìn)展.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，21（3）：68-70.