實(shí)時(shí)熒光PCR方法在食品真?zhèn)伪鎰e中的應(yīng)用

李富威，高 琴，張舒亞，*，諶鴻超，包建強(qiáng)，郭云霞

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

實(shí)時(shí)熒光PCR方法在食品真?zhèn)伪鎰e中的應(yīng)用

李富威1，2，高 琴1，張舒亞1，*，諶鴻超1，包建強(qiáng)2，郭云霞2

（1.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以其特異性、靈敏性、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品鑒偽檢測(cè)。本文闡述了實(shí)時(shí)熒光PCR的原理以及其在肉制品、高價(jià)值食品、乳制品、果汁、水產(chǎn)品和油脂鑒偽檢測(cè)方面的應(yīng)用情況。

食品，真?zhèn)舞b別，實(shí)時(shí)熒光PCR

食品加工技術(shù)的不斷發(fā)展為人們提供越來(lái)越多的品種、口味和形態(tài)各異的食品。隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的全面發(fā)展，人們的消費(fèi)觀念不斷發(fā)生變化，對(duì)食品的要求不僅是結(jié)構(gòu)的多樣性，而且日益注重食品的質(zhì)量。近年來(lái)，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多摻假、摻雜、偽造食品。食品摻假指食品中非法摻入外觀、物理性狀或形態(tài)相似的非同種類物質(zhì)，如蜂蜜中加入轉(zhuǎn)化糖，藕粉中混入薯粉;食品摻雜指在食品中非法摻入一些雜物，比如一些非同一種類或同種類劣質(zhì)物質(zhì)，糧食中摻入沙石，牛肉中摻入馬肉等;食品偽造指包裝標(biāo)識(shí)或產(chǎn)品說(shuō)明與內(nèi)裝食品的種類、品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分名不副實(shí)的假冒做法，如假燕窩、假魚(yú)翅、假乳粉、假人參、假鹿茸等[1]。這些不法行為不僅直接損害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益，而且極有可能因?yàn)槟承┻^(guò)敏原或有害成分的引入，危害消費(fèi)者健康，因此加強(qiáng)打假的力度刻不容緩，這就需要不斷提高食品檢測(cè)技術(shù)，來(lái)鑒別摻雜、造假的食品。近年來(lái)，隨著生物新技術(shù)發(fā)展，食品鑒別的技術(shù)發(fā)展也突飛猛進(jìn)，有關(guān)PCR技術(shù)鑒別食品真?zhèn)蔚难芯砍试鲩L(zhǎng)趨勢(shì)。實(shí)時(shí)熒光PCR以其高特異性、靈敏性、可定量、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的關(guān)注，越來(lái)越多的被用于食品的檢測(cè)。本文主要對(duì)近年來(lái)有關(guān)實(shí)時(shí)熒光PCR在食品真?zhèn)伪鎰e中應(yīng)用的研究報(bào)道進(jìn)行綜述。

1 實(shí)時(shí)熒光PCR方法原理

所謂的實(shí)時(shí)熒光PCR就是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)[1]，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定性及定量的分析。在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖[2]。

實(shí)時(shí)熒光PCR類型主要有特異性熒光探針類和嵌入熒光染料類兩種。特異性熒光探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物增加，如TaqMan探針、Light Cycler雙探針;嵌入熒光染料類是利用染料與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，常用的有SYBR、Eva green染料等。

2 實(shí)時(shí)熒光PCR方法優(yōu)缺點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光PCR方法自動(dòng)化程度高、靈敏度高，同時(shí)通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)熒光信號(hào)而省去了凝膠電泳的繁瑣操作，減少了假陽(yáng)性的發(fā)生率，避免了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中染色劑溴化乙錠對(duì)人體的潛在危害。另外，實(shí)時(shí)熒光PCR也有其不足之處：熒光染料類實(shí)時(shí)熒光PCR由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此DNA引物二聚體或其他非特異擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生干擾，降低了反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性。

3 實(shí)時(shí)熒光PCR在食品真?zhèn)伪鎰e中的應(yīng)用

3.1 肉類及其制品鑒偽

肉類是百姓生活的必需品。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上在肉和肉制品的生產(chǎn)與銷售中，利用摻雜造假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者。摻雜造假的手段包括混入，假冒，以病死畜禽肉充當(dāng)好肉，以不新鮮肉充當(dāng)新鮮肉，以低價(jià)肉充當(dāng)高價(jià)肉，肉注水，粉飾，香腸中食用過(guò)量淀粉等[3]。其中，尤以摻雜異種肉等造假行為較為常見(jiàn)。這不僅僅涉及經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食品安全等問(wèn)題，更直接影響著消費(fèi)者的健康。因此，對(duì)食品中原料肉進(jìn)行物種鑒定顯得十分必要，要檢測(cè)出肉制品中肉的組成比較困難，PCR方法由于其反應(yīng)時(shí)間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，成為物種鑒別中最常用的方法[4-5]。而新興的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以精確地對(duì)DNA進(jìn)行定性定量分析。

張宏偉等用PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)食物中豬成分，依據(jù)豬線粒體DNA中的細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于檢測(cè)食物中的豬源成分[6]。Jason Sawyer等采用通用引物，物種特異引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析出在牛羊混合物中牛肉的摻入量;首先測(cè)定出一系列已知牛肉含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再對(duì)未知樣品進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)出2%的牛肉摻入量[7]。Chun-Lai Zhang根據(jù)牛線粒體的cytb基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物及探針，建立了實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，可檢出35pg DNA的牛樣品，和綿羊、山羊、豬樣品無(wú)交叉反應(yīng)，運(yùn)用此方法有效的從新鮮肉及加工肉檢測(cè)到牛的DNA[8]。Miguel A.Rodríguez通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增12S rRNA基因，擴(kuò)增長(zhǎng)度425～428bp，有效地分析出混合肉中豬肉的摻入量[9]。Fajardo V用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)混合肉中鹿成分[10]。Kêppel R等建立了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)食物中的豬肉、雞肉、羊肉、馬肉成分[11]。J.Chisholm等報(bào)道了用實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)肉中馬肉和驢肉成分[12]。John JDooley等進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和火雞肉的研究[13]。

3.2 高價(jià)值食品鑒偽

隨著生活水平的提高，人們對(duì)高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的保健產(chǎn)品需求日益增長(zhǎng)，供不應(yīng)求，因此市場(chǎng)上假冒偽劣產(chǎn)品很多，如假冬蟲(chóng)夏草、假人參、假燕窩、假鹿茸等。高價(jià)值品的鑒偽方法較多，早期的鑒別研究多采用性狀鑒別、顯微鑒別及簡(jiǎn)單的理化鑒別，但存在鑒別結(jié)果可靠性不高等問(wèn)題，實(shí)時(shí)熒光PCR方法應(yīng)用于高價(jià)值食品的真?zhèn)舞b別，準(zhǔn)確性高、實(shí)用性強(qiáng)。

Yajun Wu等運(yùn)用SYBR GreenⅠ熒光 PCR快速檢測(cè)燕窩制品中燕窩成分，可檢測(cè)到0.5%的燕窩和銀耳混合物[14]。陳穎等建立了實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別魚(yú)翅的方法，能夠簡(jiǎn)單、快速、特異且靈敏地鑒別魚(yú)翅的真?zhèn)蝃15]。馬駿等公開(kāi)了運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR鑒別及檢測(cè)冬蟲(chóng)夏草的方法，除了能定性鑒別冬蟲(chóng)夏草的真?zhèn)瓮?，還能檢測(cè)樣品中冬蟲(chóng)夏草的含量，其檢測(cè)限量可低至0.0001ng/μL，比現(xiàn)有技術(shù)更加靈敏[16]。陳穎等建立了馬鹿茸、梅花鹿茸真?zhèn)舞b別的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法[17-18]。徐君怡等針對(duì)虎線粒體細(xì)胞色素b（cytb)基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立并優(yōu)化SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測(cè)鑒定體系，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到在骨粉中檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的虎源性成分，SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR方法具有方便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高和重復(fù)性好等特性，可用于虎制品的檢測(cè)鑒定[19]。徐君怡等建立SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)鑒定獅制品的方法，檢測(cè)出10pg/μL的獅組分DNA，抗干擾能力顯示在骨粉中獅的成分最低檢出含量為0.1%[20]。

3.3 乳及乳制品鑒偽

牛奶因其良好的營(yíng)養(yǎng)功效備受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞，然而伴隨著乳品加工行業(yè)的迅猛發(fā)展，在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，乳品的摻假現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。摻偽方式有摻水增加奶液體積，摻入物理、化學(xué)性質(zhì)相近物質(zhì)及液體，以次充好[3]。就世界范圍的牛奶摻假檢測(cè)而言，傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法在現(xiàn)階段仍占主導(dǎo)地位，現(xiàn)在的食品摻偽水平和手段越來(lái)越高明，使一些檢測(cè)鑒別摻偽的傳統(tǒng)方法已越來(lái)越不能滿足日益發(fā)展的社會(huì)需求[21-22]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法和手段越來(lái)越多的應(yīng)用于食品檢測(cè)中。加工食品原材料成分復(fù)雜，且大部分加工食品都經(jīng)過(guò)了高溫加熱的過(guò)程，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，生物酶失活，無(wú)法作為檢測(cè)指標(biāo)，而PCR檢測(cè)的檢測(cè)對(duì)象是脫氧核酸（DNA)，在深加工食品中仍有核酸的存在，因此，PCR檢測(cè)法不受材料的限制，可以應(yīng)用于深加工食品的檢測(cè)。

岳巧云等建立了利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法，以大豆內(nèi)源參照基因lectin為指標(biāo)，對(duì)奶粉中摻入豆粉等植物成分進(jìn)行定性、定量分析的方法[23]。Chun-Lai Zhang等建立了牛奶及奶酪中牛成分的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法[8]。López-Calleja等依據(jù)12S rRNA基因序列設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)PCR引物，從牛奶和羊奶的混合物中有效地檢出牛奶成分，特異性和靈敏度高[24]。López-Calleja等建立了實(shí)時(shí)PCR在綿羊奶混合物中成功檢出山羊奶[25]。Alba N Mininni等用實(shí)時(shí)熒光PCR檢出綿羊和山羊奶中的牛奶成分[26]。

3.4 果汁及飲料鑒偽

近年來(lái)，果汁消費(fèi)量的速度急劇增加，由于果汁是以水果為原料生產(chǎn)的，其產(chǎn)量受多種因素的影響，往往價(jià)格較高。受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，一些不法生產(chǎn)者往往采用各種手段向市場(chǎng)提供各種摻假果汁。按照果汁的定義，除以濃縮果汁為原料生產(chǎn)還原果汁時(shí)可添加與果汁濃縮時(shí)失去的天然水分等量的水外，果汁類產(chǎn)品是不允許添加任何外來(lái)物質(zhì)的。因此，任何添加了外來(lái)物質(zhì)的果汁，都認(rèn)為是摻假果汁。果汁和果汁飲料的摻假嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益，應(yīng)重視摻偽果汁檢測(cè)技術(shù)的研究。果汁鑒偽一直基于感官、理化等方法進(jìn)行檢測(cè)分析，現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，給果汁鑒偽研究注入新的血液，具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)潔的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確無(wú)誤地從基因水平分析果汁的品種和來(lái)源，其結(jié)果為證明果汁的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁?jù)[27-28]。目前，很多研究機(jī)構(gòu)將PCR技術(shù)應(yīng)用于果汁的摻偽鑒別和質(zhì)量控制中。

Morton等用PCR技術(shù)鑒別蘋果品種，為利用PCR技術(shù)進(jìn)行蘋果汁的鑒偽奠定研究基礎(chǔ)[29]。韓建勛等建立了梨成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法能夠有效檢測(cè)到果汁中的梨成分，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于果汁或食品中梨成分的鑒別[30]。Palmieri L.等報(bào)道根據(jù)5S rRNA基因序列和ANS（anthocyanidin synthase)序列設(shè)計(jì)特異性引物，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)食品中的桔子、菠蘿、藍(lán)莓、草莓成分[31]。

3.5 水產(chǎn)品鑒偽

近年來(lái)對(duì)水產(chǎn)品的消費(fèi)逐漸上升，一些不法商販在水產(chǎn)品加工中摻假造假，以低價(jià)水產(chǎn)品代替高價(jià)水產(chǎn)品出售，一方面大大損害了消費(fèi)者的利益，另一方面也造成了不正當(dāng)?shù)纳虡I(yè)競(jìng)爭(zhēng)。在水產(chǎn)品加工中，物種的原始可識(shí)別形態(tài)特征消失，這使得物種的鑒別變得相對(duì)困難。研究人員開(kāi)始用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行物種鑒定，這為判定水產(chǎn)品摻雜造假提供了技術(shù)支持。

Beatriz Herrero等運(yùn)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)和鑒定大西洋鮭，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大西洋鮭的Ct值為12±2其他物種樣品Ct值大于27，該方法可用于新鮮，冷凍，加工過(guò)的魚(yú)產(chǎn)品的檢測(cè)[32]。A.Sa′nchez等進(jìn)行了TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定歐洲無(wú)須鱈的研究，結(jié)果表明此方法快速準(zhǔn)確[33]。Beatriz Herrero等用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)和識(shí)別大西洋鱈魚(yú)，該方法可以應(yīng)用于各類產(chǎn)品，新鮮、冷藏、加工的產(chǎn)品，包括那些經(jīng)深加工的產(chǎn)品[34]。鶴田小百合等根據(jù)cytb基因設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)和鑒定太平洋鱈，阿拉斯加狹鱈，毛鱗魚(yú)的方法[35]。Martin I.Taylor等建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)鑒定大西洋鱈，黑線鱈和牙鱈的方法[36]。Itziar Lopez等用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)黃鰭金槍魚(yú)和長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)進(jìn)行定性和定量的研究[37]。

3.6 油脂鑒偽

目前我國(guó)食用油脂摻假現(xiàn)象仍很常見(jiàn)，嚴(yán)重影響人民身體健康，是油脂食品安全問(wèn)題重中之重。食用油脂的摻偽現(xiàn)象主要表現(xiàn)為未精煉的機(jī)榨及變質(zhì)油，不同油脂勾兌，在食用油中摻入非食用油脂，用煎炸餐飲殘油替代食用油脂，地溝油回收使用，動(dòng)物油脂的非法回收使用等[3]。食用油摻假摻雜不僅威脅著人們的身體健康，而且侵犯消費(fèi)者利益，影響消費(fèi)信心，不利于食用油產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食用油進(jìn)行品種鑒定及摻假檢測(cè)是新發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)方法的理化檢測(cè)和儀器分析檢測(cè)相比（如測(cè)定過(guò)氧化值、脂肪酸比例，色譜分析等)，具有檢測(cè)靈敏度高，可靠性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單和省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)[38-39]。

覃文等采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)花生的種屬特異性基因片段，定性檢測(cè)市售食用混合油脂中的花生油成分，并對(duì)其中花生油的含量檢測(cè)進(jìn)行了探索研究。結(jié)果表明，食用油脂中可提取出用于定性定量PCR的DNA，花生的Arah1基因是具有花生種屬特異性的基因，采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)Arah1基因片段可定性定量檢測(cè)混合食用油脂中的花生油成分，為定性定量檢測(cè)混合食用油中其他組分提供了技術(shù)平臺(tái)[40]。欒鳳俠等用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)成功地檢測(cè)出了食用油脂中的內(nèi)源基因和外源基因[41]。然而，由于油脂的DNA極易破壞和斷裂，所以對(duì)于精煉油的PCR檢測(cè)較難。

4 結(jié)論

近年來(lái)，市場(chǎng)上食品摻偽造假的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，為了保護(hù)消費(fèi)者利益和維護(hù)市場(chǎng)秩序，食品摻偽檢測(cè)的重要性顯而易見(jiàn)?，F(xiàn)在的食品摻偽水平和手段越來(lái)越高明，仿真度極高的劣質(zhì)產(chǎn)品給檢驗(yàn)工作帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，使許多檢測(cè)鑒別摻偽的傳統(tǒng)方法已無(wú)法測(cè)定。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)從基因水平分析食品原料和產(chǎn)品的特性，為證明食品的真?zhèn)翁峁┝丝煽康囊罁?jù)。該技術(shù)以其高準(zhǔn)確度、高精確度的優(yōu)點(diǎn)將取得更快更好的發(fā)展。本領(lǐng)域應(yīng)致力于解決當(dāng)前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中存在的一些問(wèn)題，推動(dòng)該技術(shù)在食品檢測(cè)及其他領(lǐng)域的應(yīng)用和普及。

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Application of real-time fluorescent PCR in detection of food authenticity

LI Fu-wei1，2，GAO Qin1，ZHANG Shu-ya1，*，CHEN Hong-chao1，BAO Jian-qiang2，GUO Yun-xia2
（1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine，Shanghai 200135，China;2.College of Food and Technology，Shanghai University，Shanghai 201306，China)

Real-time Fluorescent PCR which has the character of differential，sensitive，convenient and fast virtues，has been used in detection of food authenticity.The principle of real-time fluorescent PCR was discussed and expatiated its application in detection of meat products，high value food，dairy product，fruit juice，aquatic products and edible oils.

food;authentication;real-time fluorescent PCR

TS201.1

A

1002-0306（2012)14-0367-04

2011－11－18 *通訊聯(lián)系人

李富威（1985-)，女，碩士研究生，主要從事食品保鮮及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究。

上海出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（HK002-2012)。