光照對醬油發(fā)酵影響初步研究

李學(xué)偉，朱新貴*，王婷婷，曾小波

（李錦記（新會）食品有限公司，廣東 新會 529156）

醬油釀造的歷史中，我國傳統(tǒng)醬油都需要經(jīng)過“日曬夜露”。有研究認(rèn)為，醬油天然曬露過程中，太陽光為醬油所吸收，除了光能轉(zhuǎn)化為熱能外，還可能產(chǎn)生光化反應(yīng)[1]。理論上，醬油的醬醪中存在許多不飽和鍵，有些能夠吸收相應(yīng)波長的光，從而引起各種物理變化或者化合物分子鍵的伸縮卷曲、碰撞等化學(xué)變化，從而有可能影響醬油的色澤及其他理化性質(zhì)[2]。目前，國內(nèi)許多知名醬油仍采用天然曬露工藝釀制[3]，相比較，日式醬油并沒有采用中式醬油的“日曬夜露”工藝，特別是缺乏光照的因素，但其利用“春曲、夏醬、秋油”自然氣溫變化發(fā)酵的規(guī)律，采用控溫控氧發(fā)酵的方法，釀造出來的醬油卻一直以滋味鮮美，醬香、醇香、酯香濃郁占據(jù)國際醬油消費的高端市場[4-8]。

我國傳統(tǒng)醬油“日曬夜露”釀造方法，講究的是溫度、光、空氣和自然微生物。這種傳統(tǒng)的工藝，除了已知溫度、空氣和微生物在釀造中所起的作用外，對光照所產(chǎn)生的作用缺乏深入研究。光照作為重要的環(huán)境因子之一，具有熱效應(yīng)和光化學(xué)作用，能夠產(chǎn)生光熱效應(yīng)或光化學(xué)作用的往往是特定波長的光和特定的底物[9-15]。目前已有研究表明，光照能夠調(diào)節(jié)多種微生物的生長發(fā)育、代謝、向光性和生理節(jié)律變化等生命活動[16-19]。

本研究通過不同光質(zhì)對醬油品質(zhì)的影響以及比較無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的差異，初步探究光照在醬油釀造中對其品質(zhì)的影響，以期從不同角度對醬油風(fēng)味的產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行研究，也為工藝設(shè)計和改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃豆成曲和鹽（李錦記（新會）食品有限公司提供）。

1.2 主要試劑

氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、葡萄糖、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乳酸鈉、乳酸（分析純）：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；干酪素（分析純）：杭州微生物試劑廠；氨基酸（17種）（色譜純）：美國Sigma公司。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器有限公司；Brix計：日本ATAGO公司；電熱恒溫水浴鍋：北京精科華瑞儀器有限公司；全自動滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Finnigan公司；HP-INNOWAX毛細(xì)管柱：上海笛柏實驗設(shè)備有限公司；全自動氨基酸分析儀：德國Sykam公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 構(gòu)建不同光質(zhì)發(fā)酵罐

紅光、綠光和藍(lán)光為三原色光，其他色光均由三原色光構(gòu)成。因此，選取三原色光作為構(gòu)建不同光質(zhì)發(fā)酵罐的基礎(chǔ)條件。分別將三原色膜進(jìn)行透射光光譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 單色膜透射光譜圖Fig.1 Spectra of monochrome film transmittance

由圖1可見，紅膜對620nm～760nm波長范圍內(nèi)的紅光透光性在85%以上；綠膜對537nm～510nm波長范圍內(nèi)的綠光透光性達(dá)99%以上；藍(lán)膜對463nm～476nm波長范圍內(nèi)的藍(lán)光透光性達(dá)95%以上。因此，選用紅膜、綠膜、藍(lán)膜3種單色膜包裹發(fā)酵罐得到不同光質(zhì)的發(fā)酵罐，用報紙和黑色塑料袋包裹發(fā)酵罐得到無光發(fā)酵罐，透明玻璃罐為白光發(fā)酵罐。

1.4.2 不同光質(zhì)對發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

在不同光質(zhì)的發(fā)酵罐中，按1∶2的比例加入成曲和20%（w/w）濃度的鹽水，在室外非陽光直射條件下發(fā)酵3個月，以無光條件下的發(fā)酵為對照。加入鹽水1d后測定各指標(biāo)為初始值，后期定期循環(huán)，取樣測定發(fā)酵液的色澤A530、固形物含量、氨氮含量、總酸含量、紅指、黃指、還原糖含量等指標(biāo)。

1.4.3 無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的比較

在無光發(fā)酵罐和光照發(fā)酵罐中，按1∶2的比例加入成曲和20%（w/w）濃度的鹽水，按高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行定期循環(huán)澆淋。無光發(fā)酵罐進(jìn)行無光控溫發(fā)酵，0～30d溫度控制在33℃～35℃，30d～60d溫度控制在31℃～33℃，60d～90d自然溫度；光照發(fā)酵罐進(jìn)行日曬夜露自然發(fā)酵。從第4d開始，定期取樣測定醬油的酸性和中性蛋白酶活力。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行氨基酸成分和揮發(fā)性成分分析。

1.4.4 常規(guī)指標(biāo)測定

總氮、氨氮、總酸、色澤A530（稀釋10倍）、感官評定（每項最高分為10分）均按GB 18186-2000規(guī)定測定；還原糖按GB/T 5009.7-2008規(guī)定測定；固形物采用Brix計測定；蛋白酶活力按SB/T 10317-1999規(guī)定測定。

醬油紅色指數(shù)和黃色指數(shù)的測定：將醬油樣品準(zhǔn)確稀釋10倍，分別在波長460nm、510nm和610nm下測得吸光度值A(chǔ)1、A2和A3，紅色指數(shù)由10×lg（A2/A3）表示，黃色指數(shù)由10×lg（A1/A3）表示[20-21]。

1.4.5 氨基酸的測定—柱前衍生法

參考《實用食物營養(yǎng)成分分析手冊》中柱前衍生法測定醬油里的氨基酸[22]。

1.4.6 醬油揮發(fā)性成分測定

固相微萃?。喝悠?0mL于100mL頂空樣品瓶，密封后，置于40℃水浴鍋中電解攪拌，固相微萃取纖維頂空萃取30min，250℃解吸3min后進(jìn)樣。

氣相色譜分析條件：HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30mm×0.25mm）；載氣He，流速1.0mL/min；程序升溫，起始溫度45℃保持5min，升溫速率5℃/min，溫度至200℃，保持15min，升溫速度10℃/min，最終溫度220℃，保持5min；汽化室溫度220℃，進(jìn)樣量0.8μL。

質(zhì)譜分析條件：EI離子源，電子能量70eV，發(fā)射電流200μA，電子倍增器電壓350V，離子源溫度200℃，質(zhì)量掃描范圍35amu～335amu。

數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)處理由Xcalibur軟件完成，在NIST譜庫（107000個化合物的數(shù)據(jù)）和Wiley譜庫（320000個化合物的數(shù)據(jù)，Version6.0）對未知化合物進(jìn)行檢索并計算匹配度，只有當(dāng)正反匹配度均大于800（最大值為1000）時才能確證該物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光質(zhì)對發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

2.1.1 醬油發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的差異分析

醬油在不同光質(zhì)下發(fā)酵3個月，測定醬油發(fā)酵過程中的色澤A530、固形物含量、氨氮含量、總酸含量、紅指、黃指、還原糖含量等指標(biāo)，結(jié)果見圖2～圖5。

由圖2～圖5可知，不同光質(zhì)發(fā)酵醬油在其色澤A530、氨氮含量、固形物含量、還原糖含量、總酸含量、紅指、黃指等指標(biāo)之間的變化率沒有明顯差異（p>0.05）。醬油整個發(fā)酵過程非常復(fù)雜，存在淀粉的糖化、糖分的降解、酒精發(fā)酵、蛋白質(zhì)水解、香氣的形成、生酸反應(yīng)和美拉德褐變等生化反應(yīng)，這些反應(yīng)影響醬油的理化指標(biāo)。但是，這些反應(yīng)的進(jìn)行主要受到發(fā)酵的微生物、溫度、pH值、氧氣等因素影響[23]。光的作用主要表現(xiàn)為使醬醪溫度增加，而光的光化作用可能促進(jìn)上述反應(yīng)的進(jìn)行或影響微生物繁殖代謝，但實驗結(jié)果表明在醬油復(fù)雜的發(fā)酵體系中，光的光化作用對醬油的理化指標(biāo)影響很小。

2.1.2 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的感官評定

由表1可知，不同光質(zhì)發(fā)酵的醬油在色澤、香氣、滋味方面均沒有顯著差異（p>0.05），表明不同光質(zhì)對發(fā)酵醬油的感官品質(zhì)也沒有顯著影響。

圖2 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的色澤A530（a）和固形物含量（b）的變化率Fig.2 Change rate of color index A530(a) and solid content in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

圖3 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的氨氮含量（a）和總酸含量（b）的變化率Fig.3 Change rate of color index A530(a) and solid content (b) in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

由此可見，不同光質(zhì)對發(fā)酵醬油的色澤A530、固形物含量、氨基含量、總酸含量、紅指、黃指和還原糖含量等指標(biāo)，以及感官品質(zhì)沒有顯著影響。

2.2 無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的比較

圖4 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的紅指（a）和黃指（b）的變化率Fig.4 Change rate of red index (a) and yellow index (b) in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

圖5 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的還原糖含量變化率Fig.5 Change rate of reducing sugar content in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

表1 不同光質(zhì)發(fā)酵醬油的感官評定Table 1 Sensory evaluation of different kinds of soy sauce treated by different light qualities

2.2.1 無光控溫與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬醪中的蛋白酶活力以及氨基酸態(tài)氮含量比較

在發(fā)酵過程中，跟蹤無光控溫發(fā)酵醬油和傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的中性蛋白酶（NP）和酸性蛋白酶（AP）活力，以及氨氮含量的變化，結(jié)果見圖6和圖7。

圖6 無光控溫與曬露發(fā)酵液NP（a）和AP（b）活力的變化曲線Fig.6 Change rate of NP (a) and AP (b) of temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

圖7 無光控溫與曬露發(fā)酵醬油氨氮含量的變化曲線Fig.7 Change rate of ammonia nitrogen content of temperaturecontrolled and the traditional Chinese-type soy sauce

由圖6和圖7可見，無光控溫發(fā)酵醬油中的中性和酸性蛋白酶活力下降得較快，但氨氮含量卻增加得較快。

NP的酶活力在第4d～25d發(fā)酵期間出現(xiàn)快速下降，無光控溫發(fā)酵醬油的NP酶活力由610.16U/mL下降為87.84U/mL，而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油里的NP酶活力由721.36U/mL下降為309.92U/mL；發(fā)酵至50d左右，無光控溫發(fā)酵醬油的NP酶活力幾乎為零，而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的NP酶活力在后期發(fā)酵中下降非常緩慢。

AP的酶活力在第4d～16d發(fā)酵期間也快速下降，無光控溫發(fā)酵醬油的AP酶活力由203.2U/mL下降為87.76U/mL，而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油里的AP酶活力由266.4U/mL下降為118.32U/mL；發(fā)酵60d后，無光控溫發(fā)酵醬油的AP酶活力繼續(xù)快速降低，最后降為21.77U/mL，而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的AP酶活力則下降非常緩慢，最后仍保持106.31U/mL。

酶受溫度的影響有兩方面，一般規(guī)律是溫度每上升10℃反應(yīng)速度增加2倍，但高溫會使酶蛋白變性和內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，最后失去催化能力。米曲霉蛋白酶的最適溫度為40℃～45℃[8]。結(jié)合圖9進(jìn)行分析，無光控溫發(fā)酵醬油的平均發(fā)酵溫度在33℃左右，雖然能促進(jìn)酶的水解速率，但會縮短酶的存活時間；而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的平均發(fā)酵溫度在27℃左右，雖然蛋白酶的水解速率會降低，但酶的存活時間得到延長。另外，在發(fā)酵后期，無光控溫發(fā)酵醬油的氨氮含量有所降低，可能部分氨基酸參與了美拉德反應(yīng)以及被酵母繁殖所利用。

2.2.2 無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油氨基酸成分比較分析

在醬油釀造過程中，蛋白質(zhì)原料在蛋白酶的作用下，降解成胨、多肽、氨基酸。國標(biāo)中通常以氨基酸態(tài)氮的含量作為衡量成品醬油等級的標(biāo)準(zhǔn)。有些氨基酸是呈味的，如谷氨酸和天冬氨酸具有鮮味，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等具有甜味，酪氨酸、組氨酸等具有苦味[23-24]。由此可見，游離氨基酸的種類和含量是影響醬油風(fēng)味的重要因素。因此，比較游離氨基酸的組成，能更好分析無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的品質(zhì)差異。

表2 無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的游離氨基酸組成Table 2 Free amino acid composition in temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

由表2可知，無光控溫發(fā)酵醬油和傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的總游離氨基酸含量分別為5.246g/100mL和4.480g/100mL。前者是后者的1.17倍，其中鮮味、甜味和苦味氨基酸分別為0.958g/100mL和0.744g/100mL、1.909g/100mL和1.667g/100mL、2.366g/100mL和2.042g/100mL。氨基酸主要由蛋白酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生，而溫度能促進(jìn)該反應(yīng)進(jìn)行。試驗過程中，無光控溫發(fā)酵醬油和傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的平均發(fā)酵溫度分別為33℃和27℃左右，因此，前者的發(fā)酵溫度更有利于氨基酸的產(chǎn)生。

2.2.3 無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油揮發(fā)性成分比較分析

無光控溫發(fā)酵醬油與傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油主要揮發(fā)性物質(zhì)的定性，以及含量差異（峰面積歸一法）見表3。

由表3可以看出，通過質(zhì)譜定性后，共篩選出35種特征揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行比較分析，主要有醇類、酸類、醛類、酯類、酚類和其他等6大類。

醬油中的醇類物質(zhì)主要以低級醇乙醇為主，此外還有異戊醇、2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇等高級醇，都是醬油獨特的揮發(fā)性成分。檢測到的10種醇類物質(zhì)中，有6種在無光控溫發(fā)酵醬油中的含量均比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油高，但是無光控溫發(fā)酵醬油的乙醇含量相對較低，可能原因是乙醇與有機(jī)酸進(jìn)行后續(xù)的酯香反應(yīng)。總的來說，無光控溫發(fā)酵的醇類化合物的含量比曬露發(fā)酵高。醇類化合物的產(chǎn)生與酵母的繁殖代謝有關(guān)，但酵母的生長繁殖在紫外線輻射下會受到一定程度的抑制[25-26]，這可能是導(dǎo)致無光控溫發(fā)酵醬油某些醇類物質(zhì)含量較高的原因。

無光控溫發(fā)酵醬油明顯檢測到乙酸和乳酸，而傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油只檢測到乙酸，而且其含量較高。乙酸和乳酸是醬油酸類物質(zhì)的主要的成分，除了作為風(fēng)味物質(zhì)外，還起到緩解咸味和柔和各種香味，使后味延長。酸類物質(zhì)主要來源酵母的三羧酸循環(huán)和乳酸菌等[23]。

除了α-亞乙基-苯乙醛外，無光控溫發(fā)酵醬油的醛類物質(zhì)含量均比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油高。一般的醛類物質(zhì)本身不是風(fēng)味成分，但其能與醇類物質(zhì)反應(yīng)或縮合而形成香氣物質(zhì)。

無光控溫發(fā)酵醬油中的琥珀酸二乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯和鄰苯二甲酸二異丁酯的含量均比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油高，而且，這幾個酯類物質(zhì)都具有明顯的花香和果香氣味。但乳酸乙酯在無光控溫醬油里卻檢測不到。高級脂肪酸乙酯在無光控溫發(fā)酵醬油中的含量比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油低。由于無光控溫發(fā)酵的醇類化合物和有機(jī)酸相對豐富，易產(chǎn)生酯化反應(yīng)。

愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙基苯酚均是天然發(fā)酵醬油里特有的香氣物質(zhì)，這3種酚類化合物在無光控溫醬油里的含量明顯比傳統(tǒng)曬露醬油高。此外，其他的揮發(fā)性物質(zhì)在無光控溫醬油也較豐富。

由此可見，無光控溫發(fā)酵醬油中的揮發(fā)性成分較豐富，而且其大部分醇類、酸類、酯類、醛類、酚類和其他揮發(fā)性物質(zhì)的含量均比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油高。醬油里的風(fēng)味成分，除了來源原料外，主要與醬油里的微生物代謝、酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)有關(guān)，而溫度又是促進(jìn)上述反應(yīng)的關(guān)鍵因素[23，27]。我國傳統(tǒng)釀造醬油在發(fā)酵階段經(jīng)常暴曬于日光之下，可能主要與太陽光的熱能有關(guān)。因此，即使在缺乏光照或無光照的條件下，根據(jù)微生物的繁殖代謝、酶促和非酶促反應(yīng)等發(fā)酵規(guī)律，通過控溫釀造，也能獲得高品質(zhì)的醬油。

表3 無光控溫醬油與傳統(tǒng)曬露醬油中主要揮發(fā)性成分比較Table 3 Main volatile components in temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

3 結(jié)論

光具有熱作用和光化作用，熱作用表現(xiàn)為溫度的增加，光化作用是指物質(zhì)在光的照射下發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，也稱為光化反應(yīng)[1]。醬油整個發(fā)酵過程非常復(fù)雜，存在淀粉的糖化、糖分的降解、酒精發(fā)酵、蛋白質(zhì)水解、香氣的形成、生酸反應(yīng)和美拉德褐變等生化反應(yīng)，這些反應(yīng)影響醬油的理化指標(biāo)。而這些反應(yīng)主要受到發(fā)酵微生物、溫度、pH值、氧氣等因素影響[23]。通過試驗，不同光質(zhì)發(fā)酵的醬油在色澤A530、氨氮含量、固形物含量、還原糖含量、總酸含量、紅指、黃指等指標(biāo)之間的變化率沒有明顯差異（p>0.05）。經(jīng)感官評價，其色澤、香氣、滋味方面也均沒有顯著差異（p>0.05）。初步研究認(rèn)為，不同光質(zhì)對發(fā)酵醬油品質(zhì)沒有明顯影響。

對無光控溫發(fā)酵醬油和傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油進(jìn)行比較研究，中性和酸性蛋白酶活力在無光控溫發(fā)酵醬油中下降得較快，但氨氮含量卻有較快的增加。因為在酶適作用溫度范圍內(nèi)，較高的溫度能促進(jìn)酶的水解速率，但會縮短酶的存活時間。

無光控溫發(fā)酵醬油和傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油的總游離氨基酸含量分別為5.246g/100mL和4.480g/100mL。前者是后者的1.17倍，其中鮮味、甜味和苦味氨基酸分別為0.958g/100mL和0.744g/100mL、1.909g/100mL和1.667g/100mL、2.366g/100mL和2.042g/100mL。氨基酸主要由蛋白酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生，而溫度能促進(jìn)該反應(yīng)。

對醬油的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較分析，無光控溫發(fā)酵醬油中的揮發(fā)性成分較豐富，而且其大部分醇類、酸類、酯類、醛類、酚類和其他揮發(fā)性物質(zhì)的含量均比傳統(tǒng)曬露發(fā)酵醬油高。這些揮發(fā)性物質(zhì)主要與醬油里的微生物代謝、酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)有關(guān)，而溫度又是促進(jìn)上述反應(yīng)的關(guān)鍵因素。因此，即使在缺乏光照或無光照的條件下，利用自然發(fā)酵規(guī)律，通過控溫發(fā)酵，也能獲得高品質(zhì)的醬油。

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